PCR是DNA的體外擴增技術.
DNA復制是有生命力的細胞在體內 自我復制的過程 ,屬于體內擴增.
PCR(聚合酶鏈式反應)原理
PCR是體外酶促合成特異DNA片段的方法,主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環(huán)構成：即在高溫（95℃）下,待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（37～55℃）情況下,兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合,形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下,以引物3’端為合成的起點,以單核苷酸為原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新鏈.這樣,每一雙鏈的DNA模板,經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子.如此反復進行,每一次循環(huán)所產生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板,每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍,PCR產物得以2n的批數(shù)形式迅速擴增,經過25～30個循環(huán)后,理論上可使基因擴增109倍以上,實際上一般可達106～107倍.
DNA復制過程:
(一)復制的起始
1.螺旋的松弛與解鏈
⑴拓撲異構酶---能改變DNA空間構像的酶
作用：DNA復制時松弛超螺旋,以利復制叉的行進及DNA合成,合成后再引向超螺旋.
功能：不清楚,可催化體外拓撲異構化反應,拓撲異構酶分兩型.
拓撲異構酶I （topoisomerase-- I ）
作用：松弛超螺旋,不需ATP,作用機制：切開環(huán)狀一條鏈、打結與解結
原核：拓撲異構酶I對負超螺旋作用>正超螺旋
真核：拓撲異構酶I對正、負超螺旋均有作用.
拓撲異構酶Ⅱ---旋轉酶（gyrase）
作用：松弛超螺旋,作用機制：切開環(huán)狀兩條鏈、打結與解結、環(huán)連與解環(huán)連
⑵解鏈酶 （helicase）---復制蛋白rep
作用：ATP供能時,解開DNA雙鏈.
原核：編碼解鏈酶的基因是dnaB.前導鏈結合rep蛋白,隨從鏈結合解鏈酶II、Ⅲ
⑶單鏈結合蛋白（SSB）
作用：SSB與解開DNA單鏈結合,保護穩(wěn)定DNA.與新復制DNA單鏈結合,以防其降解.
螺旋松弛與解鏈過程如圖所示
2.引發(fā)
⑴引物酶（primase）
作用：以DNA為模板,自5'→3'合成RNA小片段約十幾到幾十個核苷酸,3'末端為-OH.
原核：dnaG基因編碼DnaG蛋白即引物酶.
⑵引發(fā)前體（preprimosome）
由多種蛋白因子組成復合物.
作用：合成RNA引物,沿隨從鏈復制叉的行進方向移動,在不同部位,合成RNA引物.
小結：合成RNA引物,在引物3'-OH末段進行DNA片段合成.
二 DNA鏈的延長
反應體系：DNA模板,DNA聚合酶,dNTP,引物,Mg2+
反應式：DNA+dNTP→（DNA）n+1+ppi
真核與原核中DNA聚合酶（DNA polymorase-DNApol）：
有幾種類型,作用方式相同,但各具特性及功能.
1.大腸桿菌DNA聚合酶（3種）
⑴pol I：催化5'→3'的聚合作用,合成20個核苷酸即離開模板,填充空隙.
3'→5'外切酶活性,去除錯誤堿基,有校對作用.
5'→3'外切酶活性,去除RNA引物及修正錯誤堿基.
⑵pol II：催化5'→3' DNA合成并具有3'→5'外切酶活性,體內功能不清楚.
⑶pol Ⅲ:DNA鏈延長起主要作用,細菌中以1000dNTP/秒進行聚合反應.
3'→5'外切酶活性,校對作用,與pol I配合使錯誤率降至10-6.如圖所示
DNA復制的保真性：遵守嚴格的堿基配對規(guī)律.-聚合酶對堿基的選擇功能.聚合酶對錯誤堿基的校讀作用.以上三種作用確保了DNA復制的準確性.
2、真核生物DNA聚合酶
特性與大腸桿菌相似,共五種：α、β、γ、δ、ε
⑴polδ：催化前導鏈及隨從鏈的合成,需增殖細胞核抗原蛋白PCNA的參與.
⑵polα：與引發(fā)酶配合,參與隨從鏈的合成.
⑶RFA（replication factor A）：DNA延長中RFA與單鏈結合起到SSB的作用.
三終止
連接酶（ligase）：使相鄰的DNA片段,以3',5'磷酸二酯鍵相連,需ATP供能.