PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生引物二聚體是做PCR的各位戰(zhàn)友經(jīng)常遇到的問題,下面介紹一些減少引物二聚體的方法：
1.從引物自身著手,重新設(shè)計引物,這是最根本解決這一問題的辦法；
2.可能模板有問題；
3.模板濃度過小,適當(dāng)加大模板量；
4.Taq酶,引物,Mg2+濃度可能過高,可降低它們的濃度；
5.取你所要加的上下游引物混合后,在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘,然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時冷卻,這時再加入反應(yīng)體系當(dāng)中,引物二聚體就會消失的；
6.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增強特異性；
7.PCR反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行,最后加TAq酶,PCR結(jié)束后,產(chǎn)物勿放置在室溫下過長時間,有人認(rèn)為室溫下有些TAQ酶會將多余的引物合成為二聚體；
8.增加循環(huán)數(shù)；
9.降低退火溫度后有條帶,則應(yīng)逐漸提高溫度,若提高溫度的同時產(chǎn)物量減少,則考慮增加鎂離子濃度（根據(jù)擴增片斷長度而定,片段長則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些）；
10.若降低退火溫度,發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體,而且鎂離子的濃度在 20-25mmol/l沒有區(qū)別,則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻,導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對；
11.以上次的PCR產(chǎn)物作模板二次PCR,可以提高引物與模板的特異性,減少引物二聚體,如果兩次時間間隔短的話,可以把原產(chǎn)物稀釋100－1000倍,如果間隔較長可以稀釋50－100倍.