TRIzol試劑有多組分分離作用,與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特點是可同時分離一個樣品的RNA\DNA\蛋白質(zhì)．TRIzol使樣品勻漿化,細(xì)胞裂解,溶解細(xì)胞內(nèi)含物,同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性.在加入氯仿離心后,溶液分為水相和有機(jī)相,RNA在水相中.取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì).
TRIzol試劑可用于小量樣品（50-100mg組織、5×106細(xì)胞）也適用于大量樣品（≥1g組織、>107細(xì)胞）.對人,動物,植物組織,細(xì)菌均適用,可同時處理大量不同樣品,整個提取過程在一小時內(nèi)即可完成.分離的總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染,可用于Northern Blot,dot blot,ployA篩選,體外翻譯,RNase保護(hù)分析和分子克隆.在用于RT-PCR時如果兩條引物存在于一個單一外顯子內(nèi),建議用無RNase的DNaseⅠ處理RNA樣品,避免出現(xiàn)假陽性.共純化的DNA可用作標(biāo)準(zhǔn),比較不同樣品RNA的得率,也可用于PCR和酶切.蛋白質(zhì)可用于Western Blotting.
預(yù)防RNase污染注意事項：
1． 經(jīng)常更換新手套,皮膚上常帶有的細(xì)菌,霉菌可能成為RNase的來源.
2． 使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交*污染.
3． RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染,但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿.玻璃器皿可在150℃烘烤4小時,塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘,然后用水徹底清洗,高壓滅菌,即可去除RNase.
4． 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至終濃度0.01℅v/v,放置過夜,高壓滅菌.注：DEPC有致癌之嫌,需小心操作.）
RNA的提取
準(zhǔn)備試劑：氯仿,異丙醇,75℅乙醇,無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理.樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅.
b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml,用移液器吸打幾次.TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,不取決于細(xì)胞數(shù).TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染.
c．細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞,每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol,反復(fù)吸打.加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解.一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理.
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離.
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì),脂肪,多糖或胞外物質(zhì)（肌肉,植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清.離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA.處理脂肪組織時,上層有大量油脂應(yīng)去除.取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作.
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘.
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘.樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相,上層為無色水相和一個中間層.RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅.
7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中,如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相,進(jìn)一步操作見后.用異丙醇沉淀水相中的RNA.每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘.
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀.移去上清.
9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀.每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇.2-8℃不超過7500×g離心5分鐘,棄上清.
10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥,過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低.加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液.RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解,-70℃保存.
注意事項：
1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細(xì)胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀.例如加800ml TRIzol勻漿樣品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原.糖原會與RNA一同沉淀出來,糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成,也不影響PCR反應(yīng).
2．勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月.RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上.
3．分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機(jī),2600×g離心30-60分鐘.
預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg ,腎3-4μg ,骨骼肌和腦組織1-1.5μg ,胎盤1-4μg ,上皮細(xì)胞8-15μg ,成纖維細(xì)胞5-7μg .
常見問題分析：
得率低：A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B．RNA沉淀未完全溶解
A260/A28012000×g離心10分鐘除去.
DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水測A260值.一單位A260值相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA.根據(jù)DNA產(chǎn)量可估計細(xì)胞數(shù),人,大鼠,小鼠1×106二倍體細(xì)胞含DNA的量分別為7.1μg , 6.5μg , 5.8μg .
預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取DNA分別為肝和腎3-4μg 骨骼肌,腦組織,胎盤2-3μg 人,大鼠,小鼠培養(yǎng)細(xì)胞（1×106）5-7μg 成纖維細(xì)胞5-7μg
應(yīng)用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES調(diào)pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板.
2.酶切反應(yīng) 用HEPES或1mM EDTA調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值.每μg DNA使用3-5單位的酶,80-90%的DNA是可消化的.
1ml 8mM NaOH溶解的DNA樣品pH值調(diào)節(jié)
Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)
8.4 86 7.2 23
8.2 93 7.0 32
8.0 101
7.8 117
7.5 159
注意事項：
1. DNA在中間層和有機(jī)相中時可在2-8℃保存過夜.
2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存幾個月.
3．DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置過夜,如長期保存需用HEPES調(diào)節(jié)pH至7-8并且加EDTA至1mM,可置于4℃或-20℃長期保存.氯仿是分子量比較大的有機(jī)溶劑，在提取RNA時，氯仿可以有效的使有機(jī)相和無機(jī)相迅速分離。DNA提取過程 有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合，從而使得蛋白和DNA脫離，DNA進(jìn)入水相。但是在RNA的提取過程就要避免蛋白和DNA脫離，否則DNA會釋放到水相。不管有酚也好，沒有酚也好，氯仿本身也對蛋白有變性作用，劇烈的震蕩，很容易使得DNA的親水基團(tuán)，與水相接觸。所以不要劇烈震蕩。異丙醇的作用是通過-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA鏈中的親水基團(tuán)受到保護(hù)，等同于沉淀，但是這是個反應(yīng)時發(fā)生在水相中，與前面的氯仿不矛盾。氯仿的作用有多個方面，一是作為有機(jī)溶劑變性蛋白，使其沉淀并通過離心除去，同時也通過變性作用抑制RNase活性；二是RNA提取試劑中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配試劑提的方法也用苯酚，抽提蛋白時也會用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去會損傷核酸，需要通過氯仿把水相里參與的苯酚抽提掉；三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除雜作用通常氯仿里面會加少量異戊醇（1/25），減少蛋白質(zhì)在變性過程中由于震蕩產(chǎn)生的泡沫，影響后續(xù)操作，不過個人經(jīng)驗感覺加不加沒什么太大區(qū)別，也許是我的樣品里蛋白不多吧異丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一樣。只不過用量少一點，0.6V~1V就夠了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍體積。在水相很多，離心管容積有限，加不下太多乙醇的時候一般會用異丙醇沉淀。不過感覺效果不如乙醇，偶爾會有沉淀不出來東西的時候