真核的染色體和原核不同,還要涉及核小體,DNA進(jìn)行了半保留復(fù)制,那么它又怎樣和組蛋白結(jié)合形成子染色體,現(xiàn)在要面臨以下幾個問題.
在不久之前人們都認(rèn)為核小體是全保留復(fù)制的,實際上卻并非如此.在復(fù)制時親代DNA鏈必定要分離,至少30nm的纖絲的結(jié)構(gòu)必然要破壞掉,甚至10nm 的纖絲也不能保全.人們都很想知道染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞到什么程度.這種染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有什么可觀察到的差別呢?復(fù)制的過程是短暫的,這給分析復(fù)制區(qū)的結(jié)構(gòu)帶來了很大的困難.復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)是很特殊的.它對微球菌核酸酶具有抗性,可被降解成大小不同的帶,形成核小體DNA.此提示在DNA復(fù)制中有大的蛋白復(fù)合體與之結(jié)合.復(fù)制后核小體或多或少要立即重建.
染色質(zhì)的復(fù)制并不因為組蛋白的游離而拖延合成的時間.一旦DNA被復(fù)制核小體便立即在兩條子鏈上迅速形成.我們通過電鏡照片就可以了解這一點.
組蛋白怎樣和DNA結(jié)合立即產(chǎn)生核小體這是一個多年來令人迷惑的問題.組蛋白是預(yù)先形成的一個八聚體圍繞在DNA的周圍,還是一個H32·H42四聚體作為一個核與DNA先結(jié)合,然后再加入H2A·H2B二聚體呢?受到裝配顆粒沉淀的限制,在體外的自我裝配是一個很慢的過程.要想知道可模仿的生理條件是很困難的.在體外裝配核小體有兩條途徑.
附屬蛋白涉及到幫助組蛋白和DNA結(jié)合.在非洲爪蟾的卵中發(fā)現(xiàn)了這種蛋白的候選者.爪蟾卵的抽提物能介導(dǎo)組蛋白和外源DNA裝配成核小體.此卵內(nèi)含有兩種蛋白可結(jié)合組蛋白.核質(zhì)蛋白（nucleoplasmin）結(jié)合H2A和H2B,N1蛋白結(jié)合H3和H4.這兩種蛋白的抗體可以抑制抽提液在體外組裝核小體.這些附屬蛋白的功能是什么呢?他們可能起到一種“分子伴侶”的作用.它們以一種可調(diào)控的方式將單個的組蛋白或它們的復(fù)合體（H3·H4）或H2A·H2B)與DNA結(jié)合.這可能是必然的,因為組蛋白是堿性蛋白,它們對DNA有很高的親和性.而核質(zhì)蛋白和N1是酸性蛋白,它們和靶組蛋白結(jié)合減少了負(fù)電荷.這種相互作用使組蛋白可以形成核小體而無需成為另一種動力學(xué)中間體.
在體外產(chǎn)生核小體的嘗試開始是將游離DNA和組蛋白進(jìn)行組裝,但核小體在體內(nèi)形成時僅僅在DNA復(fù)制的時候.人們用人類細(xì)胞的抽提物建立了一種模仿系統(tǒng),使SV40 DNA復(fù)制并裝配產(chǎn)生染色質(zhì).這個裝配反應(yīng)優(yōu)先發(fā)生在復(fù)制的DNA上.這需要一種輔助因子,CAF-1,它含有五個以上的亞基,總分子量238KD.CAF-1的作用是化學(xué)劑量性的.其功能是和新合成的H3,H4結(jié)合,它儲存在復(fù)制叉上,形成的核小體很快地延伸到200bp,雖然它們其中不含H1組蛋白,表明沒有H1的存在也能留下適當(dāng)?shù)拈g隔.
當(dāng)染色質(zhì)復(fù)制時,一段經(jīng)復(fù)制的DNA已和核小體結(jié)合了,產(chǎn)生兩條子鏈.在復(fù)制區(qū)核小體是怎樣預(yù)先存在的呢?是組蛋白八聚體解離成游離的組蛋白還是保持裝配的狀態(tài)呢?完整的八聚體通過組蛋白的交聯(lián)是可以被檢測出的.在復(fù)制前將細(xì)胞放在含有重標(biāo)記氨基酸中培養(yǎng)生長,以此鑒別原來的組蛋白.復(fù)制時放在輕標(biāo)記氨基酸的條件下進(jìn)行.此時組蛋白被交聯(lián)并經(jīng)密度梯度離心.若老的八聚體是全保留的話,那么此時它們應(yīng)在高密度位置,而新合成的八聚體應(yīng)當(dāng)在低密度位置,但如果老的八聚體將是呈中等密度的.實驗結(jié)果在高密度僅有少量的物質(zhì),表明組蛋白八聚體的復(fù)制不是全保留的.
核小體八聚體解聚和重新裝配的模式還不十分清楚,有可能完全解離成組蛋白組分.一種可能是八聚體丟失了一個或兩個H2A·H2B二聚體,它們被新合成的或老的所取代,在這種情況下H32·H42四聚體是保守的.有可能在轉(zhuǎn)錄時相似的情況就發(fā)生了,此H32·H42四聚體在復(fù)制時可能具有與單鏈結(jié)合的能力,這可能增加了它保留在前導(dǎo)鏈上的可能性.這就意味著至少有的組蛋白是在DNA上組裝的.