結(jié)晶紫染色法測(cè)定細(xì)胞數(shù)
1．在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164細(xì)胞的培養(yǎng)液（含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液）,37℃ 5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3小時(shí),讓細(xì)胞帖壁.
2．用RPMI-1640培養(yǎng)液10倍遞次稀釋TNF標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)需要3～5倍遞次稀釋待檢樣品,每孔加0.1ml稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品,每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)孔.對(duì)照孔6個(gè),3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培養(yǎng)液,3個(gè)陰性對(duì)照孔各加100μl RPMI-1640培養(yǎng)液.繼續(xù)培養(yǎng)18～24小時(shí).
3．甩去培養(yǎng)液,用PBS小心洗滌一次,每孔加0.1ml 10％甲醇溶液固定細(xì)胞30秒鐘.
4．吸去甲醇溶液,每孔加0.1ml結(jié)晶紫染液,室溫中放置20分鐘.
5．輕輕甩去染色液,用蒸餾水洗滌各孔,將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上吸干水分.自然干燥或37℃烘干.此板可以在室溫中長(zhǎng)期保存.
6．測(cè)定前,每孔加0.1ml 33％醋酸脫色,充分振蕩后在570nm處測(cè)定光吸收度.用光吸收度（OD）值對(duì)樣品稀釋度作圖,比較標(biāo)準(zhǔn)品曲線(xiàn)和待檢樣品曲線(xiàn)即可得到待測(cè)樣品中的細(xì)胞因子活性
Giemsa染色
1．染液配制
　　I液的配制：
　　邁格染料 lg
　　甲醇 100ml
　　在研缽內(nèi)用少量純甲醇將染料充分研磨成均勻一致的懸液,倒人燒瓶中,加入其余的甲醇后置入37℃溫箱4-6小時(shí),每隔半小時(shí)研磨半小時(shí),然后放入深棕色瓶?jī)?nèi),在室溫下保存,2周后使用.臨用前取上液40ml,加純甲醇20ml混合用作工作液.
　　Ⅱ液的配制：
　　姬氏染粉 0.6g
　　甘油 50ml
　　甲醇100ml
　　將姬氏染粉溶于甘油內(nèi),在研缽內(nèi)研磨3-4小時(shí),使之磨勻,加入純甲醇后攪拌均勻,放入深棕色瓶?jī)?nèi),室溫下保存,2周后即可使用.
　　磷酸緩沖液配制：1％磷酸氫二鈉20ml,l％磷酸二氫鈉30ml,加蒸餾水至1000ml,調(diào)整pH 6.4-6.8(用蒸餾水代替緩沖液,效果亦佳).
2．染色步驟
　　(1)自然干燥的細(xì)胞涂片(預(yù)先滴加甲醇固定更好)水平置于染色架上.
　　(2)將I液(用緩沖液或蒸餾水5-10倍稀釋)滴蓋涂片上,lO-30分鐘.
　　(3)倒棄涂片上的I液,自來(lái)水漂洗干凈.
　　(4)立即滴蓋Ⅱ液(用緩沖液或蒸餾水5-10倍稀釋)在涂片上染色10-30分鐘.
　　(5)倒棄涂片上的Ⅱ液,自來(lái)水漂洗干凈.
　　(6)趁濕加蓋片或待干后鏡檢.
3．染色結(jié)果
　　MGG染色將細(xì)胞核染成紫紅色,細(xì)胞質(zhì)和核仁染成藍(lán)紫色.