第一,克隆到原核表達(dá)系統(tǒng)中的序列必須是去掉內(nèi)含子的cDNA序列.因?yàn)樵吮磉_(dá)系統(tǒng)沒有剪切修飾內(nèi)含子的相關(guān)酶系統(tǒng).
第二,要用原核的啟動(dòng)子.檢查一下真核基因密碼子偏好是否存在原核表達(dá)系統(tǒng)的稀有密碼子.那個(gè)稀有密碼子的氨基酸會(huì)成為表達(dá)量的瓶頸.如果有,點(diǎn)突變之.
第三,真核基因可能在表達(dá)過(guò)程中需要有分子伴侶幫助折疊成正確的構(gòu)象才會(huì)有活性.如果單獨(dú)的蛋白沒有活性,應(yīng)該考慮是否需要同時(shí)克隆分子伴侶基因.
第四,注意控制表達(dá)條件,盡量不要形成包涵體.有時(shí)候表達(dá)量過(guò)高反而會(huì)形成大量包涵體.包涵體破碎提純是一個(gè)麻煩事,而且容易造成蛋白活性下降或者失活.
籠統(tǒng)這些,操作時(shí)候還要具體蛋白具體分析,優(yōu)化表達(dá)條件.比如大腸某些菌株表達(dá)一些小肽的時(shí)候加一定濃度MgCl2表達(dá)量有大幅提高,但使用其它菌株表達(dá)此肽或者該菌株表達(dá)其他蛋白就無(wú)此現(xiàn)象.多查查文獻(xiàn).