一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
1．掌握提取葉綠素的方法；
2．了解薄層層析的原理,掌握薄層層析的一般操作和定性鑒定方法
二 實(shí)驗(yàn)原理
1．葉綠素提取
高等植物體內(nèi)的葉綠體色素有葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素兩類(lèi),主要包括葉綠素a (C55H72O5N4Mg)、葉綠素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡蘿卜素(C40H56)和葉黃素(C40H56O2)等4種.葉綠素a和葉綠素b為吡咯衍生物與金屬鎂的配合物,胡蘿卜素是一種橙色天然色素,屬于四萜類(lèi),為一長(zhǎng)鏈共軛多烯,有α、β、γ三種異構(gòu)體,其中,β異構(gòu)體含量最多.葉黃素為一種黃色色素,與葉綠素同存在于植物體中,是胡蘿卜素的羥基衍生物,較易溶于乙醇,在乙醚中溶解度較小.根據(jù)它們的化學(xué)特性,可將它們從植物葉片中提取出來(lái),并通過(guò)萃取、沉淀和色譜方法將它們分離開(kāi)來(lái).
2．薄層色譜
薄層層析是快速分離和定性分析微量物質(zhì)的一種極為重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù),具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便而快速的特點(diǎn).它是將固定相支持物均勻地鋪在玻片上制成薄層板,將樣品溶液點(diǎn)加在起點(diǎn)處,置于層析容器中用合適的溶劑展開(kāi)而達(dá)到分離的目的.用此法分離時(shí)幾乎不受溫度的影響,可采用腐蝕性顯色劑,而且可在高溫下顯色,特別適用于揮發(fā)性小或在較高溫度下易發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì),同時(shí)也常用來(lái)跟蹤有機(jī)反應(yīng)或監(jiān)測(cè)有機(jī)反應(yīng)完成的程度.
薄層層析的器材選擇：
（1）基板：玻璃、塑料、金屬箔,常用玻璃板.
（2）吸附劑：
吸附劑要有合適的吸附力,并且必須與展開(kāi)劑和被吸附物質(zhì)均不起化學(xué)反應(yīng).可用作吸附劑的物質(zhì)很多,常用的有硅膠和氧化鋁,由于吸附性好,適用于各類(lèi)化合物的分離,應(yīng)用最廣.選擇吸附劑時(shí)主要根據(jù)樣品的溶解度、酸堿性及極性.氧化鋁一般是微堿性吸附劑,適用于堿性物質(zhì)及中性物質(zhì)的分離；而硅膠是微酸性吸附劑,適用于酸性物質(zhì)及中性物質(zhì)的分離.以下簡(jiǎn)單介紹吸附劑的幾個(gè)基本參數(shù).
種類(lèi)：常用：氧化鋁（強(qiáng)極性）、硅膠（中強(qiáng)極性）
不常用：硅藻土、纖維素、糖類(lèi)、活性碳
符號(hào)：H——無(wú)任何添加劑；G——加有鍛石膏（Gypsum,CaSO4·1/2 H2O）粘合劑；
F——加有熒光素（Fluorescein）
CMC——加有羧甲基纖維素鈉（Carboxymethyl cellulose）
例：硅膠GF254表示硅膠中既加有煅石膏粘合劑,也加有熒光素,可以在波長(zhǎng)254nm的紫外光下激發(fā)出熒光
粒度：目：1cm2內(nèi)的篩孔數(shù),數(shù)目越大,顆粒越小.薄層所用吸附劑顆粒較細(xì),氧化鋁為200目,硅膠為100~150目.
μ：顆粒的平均直徑,以微米表示.例如：40μ的顆粒與100目相當(dāng).
活性：
吸附劑按其含水量的多少各分為五個(gè)等級(jí)：I級(jí)含水量最少,活性最高；V級(jí)含水量最多,活性最低；但并不是活性越高分離效果越好,選用哪種活性級(jí)別的吸附劑,要用實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)確定.
酸堿性：
市售氧化鋁有酸性（用以分離酸性化合物）、中性、堿性（用以分離生物堿等堿性化合物）,其蒸餾水洗出液的pH值分別為4、7.5、9—10；其中以中性氧化鋁應(yīng)用最廣,可用來(lái)分離各種化合物,特別是那些對(duì)酸、堿敏感的化合物.
硅膠沒(méi)有酸堿性之分.
（3）展開(kāi)劑
在樣品組分-吸附劑-展開(kāi)劑三個(gè)因素中.對(duì)一確定組分,樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可看作是一不變因素,吸附劑和展開(kāi)劑是可變因素.而吸附劑的種類(lèi)有限,因此選擇合適的展開(kāi)劑就成為解決問(wèn)題的關(guān)鍵.展開(kāi)劑的選擇有以下要求:
（a）對(duì)待測(cè)組分有很好的溶解度.
（b）能使待測(cè)組分與雜質(zhì)分開(kāi),與基線(xiàn)分離.
（c）使展開(kāi)后的組分斑點(diǎn)圓而集中,不應(yīng)有拖尾現(xiàn)象.
（d）使待測(cè)組分的Rf值最好在0.0.5,如樣品中待測(cè)組分較多,Rf值則可在0.25~0.75范圈內(nèi),組分間的Rf值最好相差0.1左右.由于薄層色譜法用途非常廣泛,國(guó)內(nèi)外均有現(xiàn)成的鋪有吸附劑的薄層板出售.一般實(shí)驗(yàn)室中也可自己制備.
(e)不與組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng),或在某些吸附劑存在下發(fā)生聚合.
(f)具有適中的沸點(diǎn)和較低的粘滯度.
展開(kāi)劑的極性是指與樣品組分相互作用時(shí).展開(kāi)劑分子與吸附劑分子的色散作用、偶極作用、氫鍵作用及介電作用的總和.展開(kāi)劑要根據(jù)樣品的極性及溶解度,吸附劑活性等因素進(jìn)行選擇,總的原則是展開(kāi)劑的極性能使組分的Rf值在0.5左右.常用溶劑極性次序是：石油醚