博凌科為生物科技-為你1、欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài),約為80 90 ％致密度.2、冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì),例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生.3、注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì).DMSO 應(yīng)為試劑級等級,無菌且無色(以0.22 micron FGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10 ml 小體積分裝,4℃ 避光保存,勿作多次解凍.Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存.在開啟后一年內(nèi)使用,因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性.4、冷凍保存之細(xì)胞濃度：（1）normal human fibroblast:3 x 106 cells/ml（2）hybridoma:3 x 106 cells/ml,細(xì)胞濃度不要太高,某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后死去.（3）adherent tumor lines:7 x 106,依細(xì)胞種類而異.Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度,而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml.（4）other suspensions:10 x 106 cells/ml,human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml.5、冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 ％ DMSO,若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時(shí),亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,以防止冷凍失敗.6、冷凍方法：（1）傳統(tǒng)方法:4℃ 10 分鐘--- -20℃ 30 分鐘--- -80℃ 16 - 18 小時(shí)(或隔夜)--- 液氮槽vapor phase 長期儲存.（2）程序降溫：利用等速降溫機(jī)以1 -3℃/分鐘之速度由室溫降至120℃,放在液氮槽vapor phase 長期儲存.適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存.7、材料：（1）生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞（2）新鮮培養(yǎng)基（3）DMSO (Sigma D-2650)（4）無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)（5）0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)（6）血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片（7）等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)8、步驟：（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞生長情形.（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中,最后濃度為5-10％,混合均勻,置于室溫下待用.（3）依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,收集培養(yǎng)之細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率.（4）離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中,1 ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測.（5）冷凍保存方法1:冷凍管置于4℃ 10 分鐘 -20℃ 30 分鐘 -80℃ 16～18 小時(shí)(或隔夜) 液氮槽vapor phase 長期儲存.（6）冷凍保存方法2:冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中,再放入液氮槽中.程序?yàn)?program 7:HB CELL