1 雙波長(zhǎng)分光光度法的原理
雙波長(zhǎng)分光光度法是在傳統(tǒng)分光光度法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,它的理論基礎(chǔ)是差吸光度和等吸收波長(zhǎng).它與傳統(tǒng)分光光度法的不同之處,在于它采用了兩個(gè)不同的波長(zhǎng)即測(cè)量波長(zhǎng)（又叫主波長(zhǎng)λp,Primary Wavelength）和參比波長(zhǎng)（又叫次波長(zhǎng)λs,Second Wavelength）同時(shí)測(cè)定一個(gè)樣品溶液[1,2],以克服單波長(zhǎng)測(cè)定的缺點(diǎn),提高了測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度.
早期的雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)在測(cè)定時(shí),兩束不同波長(zhǎng)的單色光經(jīng)斬光器（Chopper,一種用于雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)中使光束按一定周期反射,遮斷或通過(guò)的裝置）處理后,以一定的時(shí)間間隔交替照射[1]比色杯,經(jīng)待測(cè)溶液吸收后,再照到光電管上,產(chǎn)生兩個(gè)不同的吸光度,再將這兩個(gè)吸光度相減,就得到了差吸光度ΔA.根據(jù)Lamber—Beer定律,
得：
Aλ p=ελpLC+Ap (1)
A λs=ελsLC+As (2)
式中 Aλ p 、 A λs—分別為待測(cè)溶液在主波長(zhǎng)和次波長(zhǎng)處的吸光度,ελp 、 ελs—分別為待測(cè)溶液在主波長(zhǎng)和次波長(zhǎng)處的摩爾吸光系數(shù)
L—光徑
C—待測(cè)溶液的濃度
Ap 、As—分別為待測(cè)溶液在主波長(zhǎng)和次波長(zhǎng)處的散射或背景吸收
當(dāng)λp 、λs相差不太大時(shí),由同一待測(cè)溶液產(chǎn)生的光散射吸光度和背景吸光度大致相等,即Ap＝A s,將（1）式－（2）式得：
Aλ p－A λs＝ΔA＝（ελp－ελs）LC （3）
對(duì)于同一待測(cè)溶液來(lái)說(shuō),ελp－ελs是一常數(shù)K,在光徑L不變的情況下,（3）式可簡(jiǎn)化為：
ΔA＝KC （4）
（4）式說(shuō)明,待測(cè)溶液在λp與λs兩個(gè)波長(zhǎng)處測(cè)定的差吸光度ΔA與試樣中待測(cè)物質(zhì)的濃度C成正比.這就是雙波長(zhǎng)法賴以建立的定量公式〔1,3〕.
雙波長(zhǎng)差吸光度法具有可以克服溶液渾濁的影響、共存組分吸收譜線疊加的干擾,以及減少比色杯的光學(xué)不均一等優(yōu)點(diǎn).它的差吸光度在2.5以內(nèi)時(shí),線性范圍良好.