聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法.在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來(lái)分離.
聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：
①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N,N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子.凝膠有
格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物,沒(méi)有或很少帶有離子的側(cè)基,因而電滲作用比較小,不易和樣品相互作用.
②由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì),在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比,形成
不同程度交鏈結(jié)構(gòu),其空隙度可在一個(gè)較廣的范圍內(nèi)變化,可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子
的大小,選擇合適的凝膠成分,使之既有適宜的空隙度,又有比較好的機(jī)械性質(zhì).一
般說(shuō)來(lái),含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠,機(jī)械性能適用于分離分子量范圍不1萬(wàn)至100萬(wàn)物
質(zhì),1萬(wàn)以下的蛋白質(zhì)則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠,而分子量特別大的可采用含
丙烯酰胺4%的凝膠,大孔膠易碎,小孔膠則難從管中取出,因此當(dāng)丙烯酰胺的濃度增 加時(shí)可以減少雙含丙烯酰胺,以改進(jìn)凝膠的機(jī)械性能.
③在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對(duì)熱穩(wěn)定.凝膠無(wú)色透明,易觀察,可用檢測(cè)儀直接測(cè)定.
④丙烯酰胺是比較純的化合物,可以精制,減少污染.合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺.丙烯酰胺稱單體,甲撐雙
丙烯酰胺稱交聯(lián)劑,在水溶液中,單體和交聯(lián)劑通過(guò)自由基引發(fā)的聚合反應(yīng)形成凝 膠.
在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應(yīng)過(guò)程中,需要有催化劑參加,催化劑包括引發(fā)劑和
另速劑兩部分.引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基,通過(guò)自由基的傳遞,使丙烯酰胺
成為自由基,發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng),加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度.常用的引發(fā)劑 和加速劑的配伍如下表：
聚合反應(yīng)催化劑配伍
引 發(fā) 劑 加 速 劑
（NH4)2S2O8 TEMED
(NH4)2S2O8DMAPN
核 黃 素 TEMED
注：(NH4)2S2O8,過(guò)硫酸胺 TEMED：N,N,N,N';四甲基乙二胺 DMAPN：β－二甲基胺基丙晴
用過(guò)硫酸銨引發(fā)的反應(yīng)稱化學(xué)聚合反應(yīng)；用核黃素引發(fā),需要強(qiáng)光照射反應(yīng)液,稱光聚合反應(yīng).聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)可受下列因素影響：
1、大氣中氧能淬滅自由基,使聚合反應(yīng)終止,所以在聚合過(guò)程中要使反應(yīng)液與空氣 隔絕.2、某些材料如有機(jī)玻璃,能抑制聚合反應(yīng).
3、某些化學(xué)藥物可以減慢反應(yīng)速度,如赤血鹽.4、溫度高聚合快,溫度低聚合慢.以上幾點(diǎn)在制備凝膠時(shí)必須加以注意.
凝膠的篩孔,機(jī)械強(qiáng)度及透明度等很大程度上由凝膠的濃度和交聯(lián)決定.每100亳升
凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度,常用T%表達(dá)；凝膠溶液中交聯(lián)劑
占單體和交聯(lián)體總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度,常用C%表示,可用下式計(jì)算：
公 式
a：丙烯酰胺克數(shù)； b：甲撐雙丙烯酰胺克數(shù)；m：緩沖液體積（毫升）
凝膠濃度過(guò)高時(shí),凝膠硬而脆,容易破碎；凝膠濃度太低時(shí),凝膠稀軟,不易操作.
交聯(lián)度過(guò)高,膠不透明并缺乏彈性；交聯(lián)度過(guò)低,凝膠呈糊狀.聚丙烯酰胺凝膠具有較高的粘度,它不防止對(duì)流減低擴(kuò)散的能力,而且因?yàn)樗哂腥?
度空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),某分子通過(guò)這種網(wǎng)孔的能力將取決于凝膠孔隙和分離物質(zhì)顆粒的大
小和形狀,這是凝膠的分子篩作用.由于這種分子篩作用,這里的凝膠并不僅是單純
的支持物,因此,在電泳過(guò)程中除了注意電泳的基本原理以外,還必須注意與凝膠本
身有關(guān)的各種性質(zhì)（網(wǎng)孔的大小和形狀等）.可通過(guò)下式計(jì)算來(lái)選擇適當(dāng)?shù)哪z網(wǎng) 孔.
公 式
式中：P為網(wǎng)孔平均直徑,C為多聚體濃度,d為該多聚體分子直徑（若不是卷曲的分
子應(yīng)為5A）,K為常數(shù),K值取決于漲膠的幾何構(gòu)型,假如多聚體的鏈?zhǔn)且越朴谥苯?
交聯(lián)的,則約為1.5根據(jù)此式,我們可以通過(guò)多聚體濃度C近似地計(jì)算出網(wǎng)孔直徑,例 如已知多聚體濃度為5%,其網(wǎng)孔平均直徑應(yīng)為：
公 式
這樣的計(jì)算是粗略的,與實(shí)際情況有一定距離,有人測(cè)定了總濃度（T）為20%的丙烯酰胺液,在六種不同比例的雙丙烯酰胺存在
下,聚合后的網(wǎng)孔大小,發(fā)現(xiàn)孔徑與總濃度有關(guān),總濃度愈大,孔徑相應(yīng)變小,機(jī)械
強(qiáng)度增強(qiáng),與總濃度不變時(shí),甲叉雙丙烯酰胺（Bis)的濃度在5%時(shí)孔徑最小,高于或
低于此值時(shí),聚合體孔徑都相對(duì)變大,凝膠孔徑在凝膠電泳中是一個(gè)重要的參數(shù),它
往往決定了電泳的分離效果.經(jīng)過(guò)不斷的實(shí)踐,得到了如表3所示的經(jīng)驗(yàn)值,在一般情況下,大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)采用7.5%濃
度的凝膠,所得電泳結(jié)果往往是滿意的,因此稱由此濃度組成的凝膠為“標(biāo)準(zhǔn)凝 膠”.
對(duì)那些用于重要研究的凝膠,最好是通過(guò)采用10%的一系列凝膠濃度梯進(jìn)行預(yù)先試驗(yàn),以選出最適凝膠濃度.