DNA復制DNA復制是指DNA雙鏈在細胞分裂以前進行的復制過程,復制的結果是一條雙鏈變成兩條一樣的雙鏈（如果復制過程正常的話）,每條雙鏈都與原來的雙鏈一樣.這個過程是通過名為半保留復制的機制來得以順利完成的.復制可以分為以下幾個階段：
(一)DNA復制的引發(fā)
復制的引發(fā)(Priming)階段包括DNA復制起點雙鏈解開,通過轉錄激活步驟合成RNA分子,RNA引物的合成,DNA聚合酶將第一個脫氧核苷酸加到引物RNA的3'-OH末端復制引發(fā)的關鍵步驟就是前導鏈DNA的合成,一旦前導鏈DNA的聚合作用開始,滯后鏈上的DNA合成也隨著開始,在所有前導鏈開始聚合之前有一必需的步驟就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滯后鏈模板轉錄一短的RNA分子.在有些DNA復制中,(如質粒ColE),該RNA分子經過加式成為DNA復制的引物.但是,在大部分DNA復制中,該RNA分子沒有引物作用.它的作用似乎只是分開兩條DNA鏈,暴露出某些特定序列以便引發(fā)體與之結合,在前導鏈模板DNA上開始合成RNA引物,這個過程稱為轉錄激活(transcriptional activation),在前導鏈的復制引發(fā)過程中還需要其他一些蛋白質,如大腸桿菌的dnaA蛋白.這兩種蛋白質可以和復制起點處DNA上高度保守的4個9bp長的序列結合,其具體功能尚不清楚.可能是這些蛋白質與DNA復制起點結合后能促進DNA聚合酶Ⅲ復合體的七種蛋白質在復制起點處裝配成有功能的全酶.DNA復制開始時,DNA螺旋酶首先在復制起點處將雙鏈DNA解開,通過轉錄激活合成的RNA分子也起分離兩條DNA鏈的作用,然后單鏈DNA結合蛋白質結合在被解開的鏈上.由復制因子X(n蛋白),復制因子Y(n'蛋白),n"蛋白,i蛋白,dnaB蛋白和dnaC蛋白等6種蛋白質組成的引發(fā)前體(preprimosome),在單鏈DNA結合蛋白的作用下與單鏈DNA結合生成中間物,這是一種前引發(fā)過程.引發(fā)前體進一步與引物酶(primase)組裝成引發(fā)體(primosome).引發(fā)體可以在單鏈DNA上移動,在dnaB亞基的作用下識別DNA復制起點位置.首先在前導鏈上由引物酶催化合成一段RNA引物,然后,引發(fā)體在滯后鏈上沿5'→3'方向不停的移動(這是一種相對移動,也可能是滯后鏈模板在移動,見后),在一定距離上反復合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成岡崎片段使用,引發(fā)體中許多蛋白因子的功能尚不清楚.但是,這些成份必須協(xié)同工作才能使引發(fā)體在滯后鏈上移動,識別合適的引物合成位置,并將核苷酸在引發(fā)位置上聚合成RNA引物.由于引發(fā)體在滯后鏈模板上的移動方向與其合成引物的方向相反,所以在滯后鏈上所合成的RNA引物非常短,一般只有3-5個核苷酸長.而且,在同一種生物體細胞中這些引物都具有相似的序列,表明引物酶要在DNA滯后鏈模板上比較特定的位置(序列)上才能合成RNA引物.
為什么需要有RNA引物來引發(fā)DNA復制呢?這可能盡量減少DNA復制起始處的突變有關.DNA復制開始處的幾個核苷酸最容易出現(xiàn)差錯,因此,用RNA引物即使出現(xiàn)差錯最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除,提高了DNA復制的準確性.RNA引物形成后,由DNA聚合酶Ⅲ催化將第一個脫氧核苷酸按堿基互補原則加在RNA引物3'-OH端而進入DNA鏈的延伸階段.
(二)DNA鏈的延伸
DNA新生鏈的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化,然而,DNA必須由螺旋酶在復制叉處邊移動邊解開雙鏈.這樣就產生了一種拓撲學上的問題:由于DNA的解鏈,在DNA雙鏈區(qū)勢必產生正超螺旋,在環(huán)狀DNA中更為明顯,當達到一定程度后就會造成復制叉難再繼續(xù)前進,從而終止DNA復制.但是,在細胞內DNA復制不會因出現(xiàn)拓撲學問題而停止.有兩種機制可以防止這種現(xiàn)象發(fā)生:[1]DNA在生物細胞中本身就是超螺旋,當DNA解鏈而產生正超螺旋時,可以被原來存在的負超螺旋所中和;[2]DNA拓撲異構酶Ⅰ要以打開一條鏈,使正超螺旋狀態(tài)轉變成松弛狀態(tài),而DNA拓撲異構酶Ⅱ(旋轉酶)可以在DNA解鏈前方不停地繼續(xù)將負超螺旋引入雙鏈DNA.這兩種機制保證了無論是環(huán)狀DNA還是開環(huán)DNA的復制順利的解鏈,再由DNA聚合酶Ⅲ合成新的DNA鏈.前已述及DNA生長鏈的延伸主要由DNA聚合酶催化,該酶是由7種蛋白質(多肽)組成的聚合體,稱為全酶.全酶中所有亞基對完成DNA復制都是必需的.α亞基具有聚合功能和5'→3'外切酶活性,ε亞基具有3'→5'外切酶活性.另外,全酶中還有ATP分子它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一個脫氧核糖核苷酸連接在RNA引物上所必需的,其他亞基的功能尚不清楚.
在DNA復制叉處要能由兩套DNA聚合酶Ⅲ在同一時間分別進行復制DNA前導鏈和滯后鏈.如果滯后鏈模板環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶,并通過DNA聚合酶Ⅲ,然后再折向與未解鏈的雙鏈DNA在同一方向上,則滯后鏈的合成可以和前導鏈的合成在同一方向上進行.
這樣,當DNA聚合酶Ⅲ沿著滯后鏈模板移動時,由特異的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸.當合成的DNA鏈到達前一次合成的岡崎片段的位置時,滯后鏈模板及剛合成的岡崎片斷便從DNA聚合酶Ⅲ上釋放出來.這時,由于復制叉繼續(xù)向前運動,便產生了又一段單鏈的滯后鏈模板,它重新環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶,并通過DNA聚合酶Ⅲ開始合成新的滯后鏈岡崎片段.通過這樣的機制,前導鏈的合成不會超過滯后鏈太多(最后只有一個岡崎片段的長度).而且,這樣引發(fā)體在DNA鏈上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移動.
按上述DNA復制的機制,在復制叉附近,形成了以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發(fā)體和螺旋構成的類似核糖體大小的復合體,稱為DNA復制體(replisome).復制體在DNA前導鏈模板和滯后鏈模板上移動時便合成了連續(xù)的DNA前導鏈和由許多岡崎片段組成的滯后鏈.在DNA合成延伸過程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用.當岡崎片段形成后,DNA聚合酶Ⅰ通過其5'→3'外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物,同時,利用后一個岡崎片段作為引物由5'→3'合成DNA.最后兩個岡崎片段由DNA連接酶將其接起來,形成完整的DNA滯后鏈.
(三)DNA復制的終止
過去認為,DNA一旦復制開始,就會將該DNA分子全部復制完畢,才終止其DNA復制.但最近的實驗表明,在DNA上也存在著復制終止位點,DNA復制將在復制終止位點處終止,并不一定等全部DNA合成完畢.但目前對復制終止位點的結構和功能了解甚少在NDA復制終止階段令人困惑的一個問題是,線性DNA分子兩端是如何完成其復制的?已知DNA復制都要有RNA引物參與.當RNA引物被切除后,中間所遺留的間隙由DNA聚合Ⅰ所填充.但是,在線性分子的兩端以5'→3'為模板的滯后鏈的合成,其末端的RNA引物被切除后是無法被DNA聚合酶所填充的.
在研究T7DNA復制時,這個問題部分地得到了解決.T7DNA兩端的DNA序列區(qū)有160bp長的序列完全相同.而且,在T7DNA復制時,產生的子代DNA分子不是一個單位T7DNA長度,而是許多單位長度的T7DNA首尾連接在一起.T7DNA兩個子代DNA分子都會有一個3'端單鏈尾巴,兩個子代DNA的3'端尾巴以互補結合形成兩個單位T7DNA的線性連接.然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA連接酶連接后,繼續(xù)復制便形成四個單位長度的T7DNA分子.這樣復制下去,便可形成多個單位長度的T7DNA分子.這樣的T7DNA分子可以被特異的內切酶切開,用DNA聚合酶填充與親代DNA完全一樣的雙鏈T7DNA分子.
在研究痘病毒復制時,發(fā)現(xiàn)了線性DNA分子完成末端復制的第二種方式.痘病毒DNA在兩端都形成發(fā)夾環(huán)狀結構.DNA復制時,在線性分子中間的一個復制起點開始,雙向進行,將發(fā)夾環(huán)狀結構變成雙鏈環(huán)狀DNA.然后,在發(fā)夾的中央將不同DNA鏈切開,使DNA分子變性,雙鏈分開.這樣,在每個分子兩端形成一個單鏈尾端要以自我互補,形成完整的發(fā)夾結構,與親代DNA分子一樣.在真核生物染色體線性DNA分子復制時,尚不清楚末端的復制過程是怎樣進行的.也可能像痘病毒那樣形成發(fā)夾結構而進行復制.但最近的實驗表明,真核生物染色體末端DNA復制是由一種特殊的酶將一個新的末端DNA序列加在剛剛完成復制的DNA末端.這種機制首先在四膜蟲中發(fā)現(xiàn).該生物細胞的線性DNA分子末端有30-70拷貝的5'TTGGGG3'序列,該細胞中存在一種酶可以將TTGGGG序列加在事先已存在的單鍵DNA末端的TTGGGG序列上.這樣有較長的末端單鏈DNA,可以被引物酶重新引發(fā)或其他的酶蛋白引發(fā)而合成RNA引物,并由DNA聚合酶將其變成雙鏈DNA.這樣就可以避免其DNA隨著復制的不斷進行而逐漸變短.
在環(huán)狀DNA的復制的末端終止階段則不存在上述問題.環(huán)狀DNA復制到最后,由DNA拓撲異構酶Ⅱ切開雙鏈DNA,將兩個DNA分子分開成為兩個完整的與親代DNA分子一樣的子代DNA.
高中生物范疇下的DNA復制
DNA的復制是一個邊解旋邊復制的過程.復制開始時,DNA分子首先利用細胞提供的能量,在解旋酶的作用下,把兩條螺旋的雙鏈解開,這個過程叫解旋.然后,以解開的每一段母鏈為模板,以周圍環(huán)境中的四種脫氧核苷酸為原料,按照堿基配對互補配對原則,在DNA聚合酶的作用下,各自合成與母鏈互補的一段子鏈.隨著解旋過程的進行,新合成的子鏈也不斷地延伸,同時,每條子鏈與其母鏈盤繞成雙螺旋結構,從而各形成一個新的DNA分子.這樣,復制結束后,一個DNA分子,通過細胞分裂分配到兩個子細胞中去!