A、將微生物的接種工具，如接種環(huán)、接種針或其他的金屬用具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，可以迅速?gòu)氐椎販缇蔄正確；
B、接種環(huán)必須冷卻后，才可以伸入菌液中蘸取一環(huán)液，否則會(huì)燒傷或燒死微生物，故B正確；
C、蘸取菌液和劃線要在火焰旁進(jìn)行，防止空氣中的雜菌，故C正確；
D、劃線時(shí)要避免最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)線連． 因?yàn)樽詈笠粎^(qū)是細(xì)菌最稀少的，而第一區(qū)是細(xì)菌最致密的，如果連在一起則有可能影響單個(gè)菌落的分離效果，故D錯(cuò)誤．
故選：D．