MTT原理
\x09MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,漢語(yǔ)化學(xué)名為 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,商品名：噻唑藍(lán).是一種黃顏色的染料.
\x09MTT比色法,是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法.其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能.二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量.在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比.該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等.它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì). 　　缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水,需被溶解后才能檢測(cè).這不僅使工作量增加,也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響,而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害.
MTT 溶液的配制方法通常,此法中的MTT 濃度為5mg/ml.因此,可以稱取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中,用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌,放4℃ 避光保存即可.在配制和保存的過(guò)程中,容器最好用鋁箔紙包住.實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來(lái)避光,覺(jué)得這樣比較好.需要注意的是,MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力,但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù).在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候,為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi).
\x09MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配,過(guò)濾后4ºC避光保存兩周內(nèi)有效,或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存,避免反復(fù)凍融,最好小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分裝在EP管里,用的時(shí)候現(xiàn)配,直接往培養(yǎng)板中加,沒(méi)必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了.
\x09MTT有致癌性,用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌,MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系,畢竟時(shí)間較短,或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉.
\x09配制MTT時(shí)用PBS（ph=7.4）溶解.PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4,定容1L.
普通MTT法實(shí)驗(yàn)步驟：1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔1000-10000個(gè)細(xì)
\x09胞接種到96孔板,每孔體積200ul.2: 培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件,培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）.3：呈色：培養(yǎng)3-5天后,每孔加MTT（噻唑藍(lán)）溶液（5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.繼續(xù)孵育4 h,
\x09終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液.
\x09每孔加150ul DMSO,振蕩10min,使結(jié)晶物充分融解.4：比色：選擇490nm波長(zhǎng),在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值,記錄結(jié)果,以時(shí)間為
\x09橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線.
藥物MTT法實(shí)驗(yàn)步驟貼壁細(xì)胞：1: 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度 1000-
\x0910000 孔,（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）.2: 5%CO2,37℃孵育,至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上,
\x09細(xì)胞貼壁后即可加藥,或兩小時(shí),或半天時(shí)間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午
\x09加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè),否則難以反應(yīng)真實(shí)情況3: 5%CO2,37℃孵育16-48小時(shí),倒置顯微鏡下觀察.4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,繼續(xù)培養(yǎng)4h.若藥物與MTT能夠反應(yīng),
\x09可先離心后棄去培養(yǎng)液,小心用PBS沖2-3遍后,再加入含MTT的培養(yǎng)液.5: 終止培養(yǎng),小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液.6: 每孔加入150ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解.在酶聯(lián)免
\x09疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值.7: 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）,對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介
\x09質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）.
懸浮細(xì)胞：1: 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml,按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培
養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（放線菌素D有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲(chǔ)存液100g/ml,需預(yù)試尋找最佳稀釋度,1:10-1:20)；③需檢測(cè)物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔）,共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）.每板設(shè)對(duì)照（加100l 1640）
2: 置37℃,5%CO2孵育16-48小時(shí),倒置顯微鏡下觀察.3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,即0.5%MTT）,繼續(xù)培養(yǎng)4 h.（懸浮細(xì)胞推薦使用
WST-1,培養(yǎng)4 h后可跳過(guò)步驟4）,直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）
\x094、離心（1000轉(zhuǎn)x10min）,小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解.在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值.
\x095、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜DMSO）,對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）,每組設(shè)定3復(fù)孔.
注意事項(xiàng)：(1) 選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度.(2) 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn).在呈色后盡量吸盡孔
\x09內(nèi)殘余培養(yǎng)液.(3) 設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照.其他試驗(yàn)步驟保持一致,
\x09最后比色以空白調(diào)零.
(4) MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間,超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系.
\x09(5) 用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞做MTT測(cè)細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少M(fèi)TT和DMSO合適
\x09根據(jù)書(shū)上說(shuō)的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液,便于
\x09DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測(cè)定
\x09(6) 一般每孔4000個(gè)細(xì)胞為宜,既細(xì)胞濃度在20000個(gè)/ml,MTT加20ul,作用四小時(shí)后洗掉上清液,注意不要將甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脫色搖床上振蕩10分鐘,然后測(cè)吸光值.