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  • 大腸桿菌cacl2處理

    大腸桿菌cacl2處理
    生物人氣:518 ℃時間:2020-01-29 14:49:05
    優(yōu)質解答
    你是要問處理的目的還是要做感受態(tài)細胞的過程啊
    下面是做感受態(tài)細胞的過程:
    1.從37℃培養(yǎng)16~20 h 的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52),或1 ml 新鮮的16~20 h過夜培養(yǎng)物,轉到一個含有100ml LB培養(yǎng)基的1 L 或500 ml 培養(yǎng)瓶中.于37℃振搖培養(yǎng)約2~3 h(旋轉搖床200~300 r/min),每隔20~30 min測量OD600值≈0.4.
    2.在無菌條件下將細菌轉移到一個,用冰預冷的50 ml 聚丙烯離心管中,冰上放置10~20 min.
    3.于4℃4000轉 /分離心10 min,回收細菌細胞.
    4.將管倒置1 min,以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡.
    5.以10 ml 用冰預冷的0.1 mM CaCl2重懸每份沉淀,放于冰上 ,4℃4000轉 /分離心10 min,回收細菌細胞.
    6.每50 ml 初始培養(yǎng)物用2 ml 冰預冷的0.1 M CaCl2重懸每份沉定,此時,可以迅速將細胞分裝成小份,液氮中冰凍,-70℃貯存?zhèn)溆?
    7.用無菌吸頭從感受態(tài)細胞懸液中取200 μl 轉移到無菌的微量離心管中,加DNA或連接反應混合物(體積≤10 μl,DNA≤50 ng),輕旋以混勻內容物,冰浴30 min.
    8.將離心管放到預加溫到42℃的水浴中,90 s.
    9.將混合物快速轉移到冰浴中,冷卻1~2分鐘,加入適當的培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)45 分鐘,使細胞復蘇,并表達質粒所攜帶的轉化基因.
    10.將適當體積(每個90 mm平板可達200 μl)已轉化的感受態(tài)細胞轉移到相應抗生素的平板培養(yǎng)基上.
    11.將平板置于室溫至液體被吸收 ,倒置平板于37℃培養(yǎng)箱中,12~16 h,平板培養(yǎng),克隆在此期間應該出現,否則轉化不成功.
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