聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù).它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定.過去幾天幾星期才能做到的事情,用PCR幾小時(shí)便可完成.PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑.
PCR技術(shù)簡史
PCR的最早設(shè)想 核酸研究已有100多年的歷史,本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù),Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性,與合適的引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”.
PCR的實(shí)現(xiàn) 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng).其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制,只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合適的緩沖體系,DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間.
PCR的改進(jìn)與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段,其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫,90℃會(huì)變性失活,每次循環(huán)都要重新加.②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行,容易發(fā)生模板和引物之 間的堿基錯(cuò)配,其PCR產(chǎn)物特異性較差,合成的DNA片段不均一.此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn),但由于 Klenow酶不耐熱,在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí),會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化,每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期,給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難.這使得 PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視.1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR,其擴(kuò)增的DNA片段很均一,真實(shí)性也較高,只有所期望的一種DNA片段.但每循環(huán)一次,仍需加入新酶.1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶.此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫,在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%,在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的 60%,在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%.②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化,不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶.③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效 率,增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb).由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率,因而其靈敏性也大大提高.為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別,將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase).此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用.
PCR技術(shù)基本原理
PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的 天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物.PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加 熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引 物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合 物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板.每完成一個(gè)循環(huán)需 2～4分鐘,2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍.到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝.
PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行,使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升.反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算.Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù),X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率,n代表循環(huán)次數(shù).平均擴(kuò)增效率的理論值為100%, 但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值.反應(yīng)初期,靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式,隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加,而進(jìn) 入線性增長期或靜止期,即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?大多數(shù)情 況下,平臺(tái)期的到來是不可避免的.
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分.短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5’端之間,是需要擴(kuò)增的特定片段.短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所 結(jié)合的模板不一樣而形成的,以一個(gè)原始模板為例,在第一個(gè)反應(yīng)周期中,以兩條互補(bǔ)的DNA為模板,引物是從3’端開始延伸,其5’端是固定的,3’端則沒 有固定的止點(diǎn),長短不一,這就是“長產(chǎn)物片段”.進(jìn)入第二周期后,引物除與原始模板結(jié)合外,還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合.引物在與新鏈結(jié)合 時(shí),由于新鏈模板的5’端序列是固定的,這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點(diǎn),保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的 “短產(chǎn)物片段”.不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加,而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加,幾乎可以忽略不計(jì), 這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化,就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用.
PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：
10×擴(kuò)增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul
PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度.理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增.
設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp,常用為20bp左右.
②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段.
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶.ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3’端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶.
⑤引物3’端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗.
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn),這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處.
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性.
引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì).
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng), 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)),濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少.
dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性.dNTP溶液呈酸性,使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存.多次凍融會(huì)使dNTP降解.在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50～200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低),就會(huì)引起錯(cuò)配.濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量.dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低.
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本. SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀 核酸.提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng).一般臨床檢測標(biāo)本,可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接 用于PCR擴(kuò)增.RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜.Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少.
PCR反應(yīng)條件的選擇
PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù).
溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn).在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對(duì)于較短靶基因(長度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).
①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因.一般情況下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性,若低于93℃則 需延長時(shí)間,但溫度不能過高,因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響.此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗.
②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素.變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合.由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞.退火溫度與時(shí)間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長 度.對(duì)于20個(gè)核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想.引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,提高PCR反應(yīng)的特異性.復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合.
③延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時(shí), DNA合成幾乎不能進(jìn)行.
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合.PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時(shí)間1min是足夠 的.3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min.延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn).對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增,延伸時(shí)間要稍長些.
循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度.PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度.一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多.
PCR反應(yīng)特點(diǎn)
特異性強(qiáng) PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對(duì)原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
④靶基因的特異性與保守性.
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵.引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的.聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度.再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高.
靈敏度高 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級(jí)的起始待測模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平.能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌.
簡便、快速 PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng).擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣.
對(duì)標(biāo)本的純度要求低 不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板.可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析
PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增 ,其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠,必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定,才能得出正確的結(jié)論.PCR產(chǎn)物的分析,可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法.
凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳,EB溴乙錠染色紫外儀下觀察,初步判斷產(chǎn)物的特異性.PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致,特別是多重PCR,應(yīng)用多對(duì)引物,其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小,這是起碼條件.
瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用1～2%的瓊脂糖凝膠,供檢測用.
聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好,條帶比較集中,可用于科研及檢測分析.
酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn),用相應(yīng)的酶切、電泳分離后,獲得符合理論的片段,此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定,又能對(duì)靶基因分型,還能進(jìn)行變異性研究.
分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù),也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法.
Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針,與PCR產(chǎn)物雜交.此法既可作特異性鑒定,又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度,還可知其分子量及條帶形狀,主要用于科研.
斑點(diǎn)雜交： 將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上,再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交,觀察有無著色斑點(diǎn),主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析.