顯微鏡之介紹
光學(xué)顯微鏡是為了使肉眼看不清楚的標(biāo)本影像,人們設(shè)想經(jīng)過一種裝置,使肉眼能夠觀察到該標(biāo)本組織形態(tài)和其間的結(jié)構(gòu).這種設(shè)想的裝置就被后人創(chuàng)造問世了.當(dāng)前廣泛應(yīng)用在各種微小物體的觀察、測定、分析、分類、鑒定等.在波長范圍上也不限於可見光波段(4000~7000 )而且(＞2000 )到紅外(1~2u)以及用眼睛觀察、顯微、攝影和一般輻射檢測器放大.
顯微鏡的分類是根據(jù)照明方法,有透射型與反射(落射)型二種.透射型顯微鏡是應(yīng)用透射照明通過透明物體的打光方法.反射型顯微鏡是以物鏡上方打光到(落射照明)不透明的物體上.另一種分類方法,系根據(jù)觀察方法的差異,分為明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡、相位差顯微鏡、偏光顯微鏡、干涉相位差顯微鏡、螢光顯微鏡等.每種顯微鏡一般又各有透射型和反射型二種.在這些顯微鏡中,特別是明視野顯微鏡是構(gòu)成所有顯微鏡中組成最基本的基礎(chǔ).通過這種顯微鏡觀察的物體,穿過透過(吸收)率、反射率,因場所不同而各不相同,這種物體被稱為隨照明光強(qiáng)度(振幅)變化振幅物體,無色透明物體只有在照明相位改變時(shí),才能被肉眼觀察到,由於明視野顯微鏡不能改變相位,所以對透明不染色標(biāo)本不能被觀察到.
倍率、數(shù)值孔徑與視場數(shù)
顯微鏡的綜合倍率是物鏡倍率G1與目鏡倍率G2的乘積,G＝G1×G2.G1是1~100倍,G2是5~20的范圍.
數(shù)值孔徑(Numerical Aperture)N.A.是決定物鏡的分辨率、焦深、圖像亮度的基本數(shù)據(jù),如圖所示,當(dāng)物鏡焦點(diǎn)對好后,物鏡前透鏡最邊緣處的傾斜光線與顯微鏡光軸所交角成α,此即該物鏡的半孔徑角設(shè)標(biāo)本數(shù)據(jù)空間的折射率為n,則N.A.＝n×sinα.
n通常在空氣中為1,在物鏡與標(biāo)本間浸入水、甘油、油脂時(shí),該標(biāo)本折射率,即隨浸液不同而異.這種物鏡稱為浸液系物鏡；如是空氣時(shí),稱為乾燥系物鏡.圖1左半部分表示浸液系,右半部分表示乾燥系的情況.
在顯微鏡上,限制視野的裝置是視野光圈.以物鏡側(cè)觀看這種視野光圈時(shí)的直徑以mm單位表示的值稱為視野數(shù).實(shí)際視野＝視野.
實(shí)際視野＝視野數(shù)／物鏡倍率
例如,視野數(shù)為20,則10×物鏡就觀看2mm視野范圍.應(yīng)用聚光鏡時(shí),根據(jù)可變的視野光圈,再決定選用聚光鏡的N.A.值,其值是取決於可變聚光鏡孔徑光圈來確定.
暗視野顯微鏡
暗視野顯微鏡由於不將透明光射入直接觀察系統(tǒng),無物體時(shí),視野暗黑,不可能觀察到任何物體,當(dāng)有物體時(shí),以物體衍射回的光與散射光等在暗的背景中明亮可見.在暗視野觀察物體,照明光大部分被折回,由於物體(標(biāo)本)所在的位置結(jié)構(gòu),厚度不同,光的散射性,折光等都有很大的變化.
相位差顯微鏡
相位差顯微鏡的結(jié)構(gòu)：
相位差顯微鏡,是應(yīng)用相位差法的顯微鏡.因此,比通常的顯微鏡要增加下列附件：
(1) 裝有相位板(相位環(huán)形板)的物鏡,相位差物鏡.
(2) 附有相位環(huán)(環(huán)形縫板)的聚光鏡,相位差聚光鏡.
(3) 單色濾光鏡-(綠).
各種元件的性能說明如下：
(1) 相位板使直接光的相位移動 90°,并且吸收減弱光的強(qiáng)度,在物鏡后焦平面的適當(dāng)位置裝置相位板,相位板必須確保亮度,為使衍射光的影響少一些,相位板做成環(huán)形狀.相位板,相位膜及吸收膜加工成圖5形狀.
(2) 相位環(huán)(環(huán)狀光圈)是根據(jù)每種物鏡的倍率,而有大小不同,可用轉(zhuǎn)盤器更換.
(3) 單色濾光鏡系用中心波長546nm(毫微米)的綠色濾光鏡.通常是用單色濾光鏡入觀察.相位板用特定的波長,移動90°看直接光的相位.當(dāng)需要特定波長時(shí),必須選擇適當(dāng)?shù)臑V光鏡,濾光鏡插入后對比度就提高.此外,相位環(huán)形縫的中心,必須調(diào)整到正確方位后方能操作,對中望遠(yuǎn)鏡就是起這個(gè)作用部件.
使用時(shí)的注意事項(xiàng)
使用時(shí),最重要的注意事項(xiàng)為下列三點(diǎn)：
(1)執(zhí)行正確的操作方法.
(2)根據(jù)標(biāo)本的要求,選擇合適的相位差物鏡.
(3)用其他觀察方法作比較,對標(biāo)本作出正確的判斷.
1.正確操作的最重要事項(xiàng)必須正確地調(diào)整好相位環(huán)的中心.若用圖6中的幾種形狀的容器,是不能正確地調(diào)到中心位置的.因而作為相位差觀察用是不合適的.
對相位差像的判斷和明視野象的判斷是不相同的.要注意相差法所持有的特點(diǎn)和不足點(diǎn),相位差物鏡的選擇方法同上.要與其他的觀察法作比較,以及正確地制作標(biāo)本的方法,這些都是使用時(shí)必要的綜合注意事項(xiàng).
螢光顯微鏡
在螢光顯微鏡上,必須在標(biāo)本的照明光中,選擇出特定波長的激發(fā)光,以產(chǎn)生螢光,然后必須在激發(fā)光和螢光混合的光線中,單把螢光分離出來以供觀察.因此,在選擇特定波長中,濾光鏡系統(tǒng),成為極其重要的角色.
螢光顯微鏡原理：
(A) 光源：光源幅射出各種波長的光(以紫外至紅外).
(B) 激勵(lì)濾光源：透過能使標(biāo)本產(chǎn)生螢光的特定波長的光,同時(shí)阻擋對激發(fā)螢光無用的光.
(C) 螢光標(biāo)本：一般用螢光色素染色.
(D) 阻擋濾光鏡：阻擋掉沒有被標(biāo)本吸收的激發(fā)光有選擇地透射螢光,在螢光中也有部分波長被選擇透過.