苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖,并迅速脫水生成糖醛衍生物,然后與苯酚生成橙黃色化合物.再以比色法測定.
[操作]
1．制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中,加水至刻度,分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸餾水補(bǔ)至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻,室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度,以2.0ml水按同樣顯色操作為空白,橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù),縱坐標(biāo)為光密度值,得標(biāo)準(zhǔn)曲線.
2．樣品含量測定：
①取樣品1克（濕樣）加1ml 15%TCA溶液研磨,再加少許5％TCA溶液研磨,倒上清液于10毫升離心管中,再加少許5％TCA溶液研磨,倒上清液,重復(fù)3次.最后一次將殘?jiān)黄鸬饺腚x心管.注意：總的溶液不要超出10毫升.（既不要超出離心管的容量）.
②離心,轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分鐘,共三次.第一次15分鐘,取上清液.后兩次各5分鐘取上清液到25毫升錐形比色管中.最后濾液保持18毫升左右.（測肝胰腺樣品時(shí),每次取上清液時(shí)應(yīng)過濾.因?yàn)槠渲竞看笕菀讑A帶殘?jiān)?）
③水浴,在向比色管中加入2毫升6mol/L 鹽酸之后搖勻,在96℃水浴鍋中水浴2小時(shí).
④定容取樣.水浴后,用流水冷卻后加入2毫升6mol/L 氫氧化鈉搖勻.定容至25毫升的容量瓶中.吸取0.2 ml的樣品液,以蒸餾補(bǔ)至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度.每次測定取雙樣對(duì)照.以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量.
[注意]
測定時(shí)根據(jù)光密度值確定取樣的量.光密度值最好在0.1——0.3之間.比如：小于0.1之下可以考慮取樣品時(shí)取2克,仍取0.2ml樣品液,如大于0.3可以減半取0.1ml的樣品液測定.