提取基因組DNA和細(xì)胞核DNA是不同的方法
提取細(xì)胞核要先把細(xì)胞破碎分離出細(xì)胞核,要在甘油或其他保護(hù)劑中進(jìn)行
SDS十二烷基磺酸鈉：可破壞細(xì)胞膜、核膜,并使組織蛋白與DNA分離
CATB是一種抽提液,破壞細(xì)胞膜的~具體忘了~
DNA不溶于異丙醇,異丙醇可以析出DNA,產(chǎn)生白色絮狀沉淀,用槍頭挑出就可以了
以下是一些具體方法,希望有用
基因組DNA提取方法
制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟,通常要求得到的片段的長(zhǎng)度不小于100-200kb.在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素,以保證DNA的完整性,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ).主要是CTAB方法,其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法.2化學(xué)方式：異硫氰酸胍法,堿裂解法3生物方式:酶法.根據(jù)核酸分離純化方式的不同有:硅質(zhì)材料、陰離子交換樹脂等
試驗(yàn)步驟：
1、貼壁細(xì)胞用胰酶消化,離心收集.
2、細(xì)胞重懸于冰冷的PBS漂洗一次,離心收集.試驗(yàn)步驟2再重新作一邊.
3、加入5mlDNA提取緩沖液,(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混勻.
4、加入25ul蛋白酶K,使終濃度達(dá)到100ug/ml,混勻,50℃水浴3h,
5、用等體積的酚抽提一次,2500rpm離心收集水相,用等體積的（酚,氯仿,異戊醇）混合物抽提一次,2500r/min離心收集水相
6、用等體積的氯仿,異戊醇抽提一次.加入等體積的5mol/L的LiCL,混勻,冰浴,10min..
7、2500rpm離心10min.轉(zhuǎn)上清于一離心管中.加入等體積的異丙醇.室溫10min.
2500rpm,離心10min.棄上清.
8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預(yù)冷無水乙醇.-20℃20min.
9、12000r/min,室溫離心5min.棄上清.將DNA溶于適量TE中.

外周血DNA提取技術(shù)
分離外周血白細(xì)胞提取方法：
試驗(yàn)步驟：
1、取人肘靜脈血5ml,EDTA抗凝,2500rpm離心10min.
2、小心吸取上層血漿,分裝到3個(gè)0.5ml離心管中.
3、在血細(xì)胞中加入3倍體積的溶血液,搖勻,冰浴15min.
4、2500rpm離心10min,棄上清.
5、加入10ml溶血液,搖勻,冰浴15min.
6、3000rpm離心10min,棄上清.
7、倒置離心管,去掉殘液.
8、得白細(xì)胞,－80?C凍存.
試驗(yàn)要求：
血至分離白細(xì)胞之間隔時(shí)間在室溫下放置不超過2h,4℃放置不超過5h,以防白細(xì)胞自溶.

氯仿法抽提外周血白細(xì)胞基因組DNA：
試驗(yàn)試劑：
Ligsisbuffer：
133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加滅菌去離子水至1000ml,高壓滅菌.
ACD抗凝劑：檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g；最后加滅菌去離子水至350ml,高壓滅菌.
提取緩沖液（Extractionbuffer）：
10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加滅菌去離子水至100ml,高壓滅菌
試驗(yàn)步驟：
1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl,充分顛混至清亮.以4000rpm,離心5min.棄上清液.
2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl,充分勻漿.以6000rpm,離心5min.
3、徹底棄去上清,加入extractionbuffer500μl（裂解細(xì)胞）,混勻置于37℃,水溶1h.
4、加入8μl的蛋白酶K,顛混,37℃過夜（或55℃,3h,但是37℃效果要好些）.
5、每管加入450μl飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min,以5500rpm,離心15min.
6、取上清,每管加入250μl飽和酚和250μl氯仿－異戊醇,搖勻10min,以5500rpm,離心15min.
7、取上清,每管加入500μl氯仿－異戊醇,搖勻10min,以5500rpm,離心15min.
8、取上清,每管加50μl的3M的NaAC＋,適量無水乙醇（預(yù)冷）至滿,搖勻放入-20℃保存2h以上.
9、以12000rpm,離心20min.去上清,加入70％乙醇500μl,以12000rpm,離心5min,去上清,50－60℃干燥.
10、加入50μl滅菌去離子水,轉(zhuǎn)彈,混勻.

NaI提取法提取外周血白細(xì)胞基因組：
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中,12000rpm離心12min.
2、棄上清,加雙蒸水200ul溶解,搖勻20s.
3、混勻后加6MNaI溶液200ul,搖勻20s.
4、加入氯仿/異戊醇（24：1）400ul,邊加邊搖,搖勻20s,12000rpm離心12min.
5、取上層液350ul,加入另一新eppendorf管中,加0.6倍體積異丙醇,搖勻20s,室溫放置15min,靜置后的反應(yīng)體系15000rpm離心12min,使沉淀緊貼eppendorf管壁.
6、棄異丙醇,加70％乙醇1ml（不振動(dòng)）,以15000rpm離心12min.
7、棄乙醇,敞開eppendorf管蓋,烘干（37℃恒溫箱）后,加1xTE溶液30ul,溶解DNA＞12h以上,制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

常用的外周血白細(xì)胞基因提取方法：
試驗(yàn)原理：
苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑,反復(fù)抽提,使蛋白質(zhì)變性,SDS(十二烷基磺酸鈉)將細(xì)胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子,核蛋白變性降解,使DNA從核蛋白中游離出來.DNA易溶于水,不溶于有機(jī)溶劑.蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán),也容易進(jìn)行水合作用,并在表面形成一層水化層,使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液.當(dāng)有機(jī)溶液存在時(shí),蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞,變性沉淀.離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相),DNA存在于上層水相中,蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間.酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質(zhì).氯仿的作用是有助于水相與有機(jī)相分離和除去DNA溶液中的酚.抽提后的DNA溶液用2倍體積的無水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA,回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的鹽,真空干燥,用TE緩沖液溶解DNA備用.
試驗(yàn)步驟：
1、將1mlEDTA抗凝貯凍血液于室溫解凍后移入5ml離心管中,加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS）,混勻,3500rpm離心15min,傾去含裂解紅細(xì)胞的上清.重復(fù)一次.用0.7mlDNA提取液混懸白細(xì)胞沉淀,37℃水浴溫育1h.
2、將上述DNA提取液混懸白細(xì)胞,37℃水浴溫育1h后,加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉(zhuǎn)動(dòng)混勻,液體變粘稠.50℃水浴保溫3h,裂解細(xì)胞,消化蛋白.保溫過程中,應(yīng)不時(shí)上下轉(zhuǎn)動(dòng)幾次,混勻反應(yīng)液.
3、反應(yīng)液冷卻至室溫后,加入等體積的飽和酚溶液,溫和地上下轉(zhuǎn)動(dòng)離心管5-10min,直至水相與酚相混勻成乳狀液.5000rpm離心15min,用大口吸管小心吸取上層粘稠水相,移至另一離心管中.重復(fù)酚抽提一次.加等體積的氯仿：異戊醇（24：1）,上下轉(zhuǎn)動(dòng)混勻,5000rpm離心15min,用大口吸管小心吸取上層粘稠水相,移至另一離心管中.重復(fù)一次.
4、加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇,室溫下慢慢搖動(dòng)離心管,即有乳白色云絮狀DNA出現(xiàn).用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA,轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中,加70%乙醇0.2ml,以5000rpm離心5min.洗滌DNA,棄上清,去除殘留的鹽.重復(fù)一次.室溫?fù)]發(fā)殘留的乙醇,但不要讓DNA完全干燥.加TE液20ul溶解DNA,置于搖床平臺(tái)緩慢搖動(dòng),DNA完全溶解通常需12-24h.制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

真核細(xì)胞DNA的制備
一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-9bp,可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞,隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的.這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析,還可用于PCR的模板、文庫構(gòu)建等實(shí)驗(yàn).
根據(jù)材料來源不同,采取不同的材料處理方法,而后的DNA提取方法大體類似,但都應(yīng)考慮以下兩個(gè)原則：
1、防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解.
2、盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞.
試劑準(zhǔn)備：
1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0).
2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl.
3、裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml.
4、20%SDS
5、2mg/ml蛋白酶K
6、Tris飽和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7、無水乙醇、75%乙醇
試驗(yàn)步驟：
材料處理：
1、新鮮或冰凍組織處理：
1)取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎,加TE0.5ml,轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿.
2)將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中.
3)加20%SDS25ml,蛋白酶K(2mg/ml)25ml,混勻.
4)60°C水浴1-3hr.
2、培養(yǎng)細(xì)胞處理：
1)將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后,用TBS洗滌一次.
2)離心4000g×5min,去除上清液.
3)加10倍體積的裂解緩沖液.
4)50-55°C水浴1-2hr.
DNA提?。?br/>1、加等體積飽和酚至上述樣品處理液中,溫和、充分混勻3min.
2、離心5000g×10min,取上層水相到另一1.5ml離心管中.
3、加等體積飽和酚,混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中.
4、加等體積酚/氯仿,輕輕混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中.如水相仍不澄清,可重復(fù)此步驟數(shù)次.
5、加等體積氯仿,輕輕混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中.
6、加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的無水乙醇,輕輕倒置混勻.
7、待絮狀物出現(xiàn)后,離心5000g×5min,棄上清液.
8、沉淀用75%乙醇洗滌,離心5000g×3min,棄上清液.
9、室溫下?lián)]發(fā)乙醇,待沉淀將近透明后加50-100mlTE溶解過夜.

植物組織中DNA的提取
試驗(yàn)原理：
脫氧核糖核酸（deoxribonucleicacid,DNA）是一切生物細(xì)胞的重要組成成分,主要存在于細(xì)胞核中,鹽溶法是提取DNA的常規(guī)技術(shù)之一.從細(xì)胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA,其中還含有大量RNA,即核糖核蛋白.如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術(shù)的關(guān)鍵.DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中,而RNA則能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中,利用這一性質(zhì)就可以將二者從破碎細(xì)胞漿液中分開.制備過程中,細(xì)胞破碎的同時(shí)就有Dnase釋放到提取液中,使DNA因被降解而影響得率,在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA,既可抑制酶的活性又可使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離,再加入陰離子去垢劑0.15％的SDS,經(jīng)過2h攪拌,或用氯仿－異醇除去蛋白,通過離心使蛋白質(zhì)沉淀而除去,得到的是含有核酸的上清液.然后用95％的預(yù)冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質(zhì)的提取液中沉淀出來.
植物DNA的SDS提取法：
試驗(yàn)試劑：
1、研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl,13.25g檸檬酸三鈉,37.2gEDTA－Na分別溶解后合并為一,用0.2mol/L的NaOH調(diào)至pH7.0,并定容至1000ml.
2、10×SSC溶液：稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉,分別溶解,一起定容至1000ml.
3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍.
4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍.
5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液,用1mol/LHCl,pH至5.0,使用前經(jīng)80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）.
6、氯仿－異戊醇：按24ml氯仿和1ml異戊醇混合.
7、5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4．H2O70.23g,先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml.
8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學(xué)試劑的重結(jié)晶：將SDS放入無水酒精中達(dá)到飽和為止,然后在70～80℃的水浴中溶解,趁熱過濾,冷卻之后即將濾液放入冰箱,待結(jié)晶出現(xiàn)再置室溫下涼干待用.
9、1mol／LHCl.
10、0.2mol/LNaOH.
11、二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中,添加1.5ml濃硫酸,裝入棕色瓶,貯存暗處,使用時(shí)加0.1ml乙醛液〔濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕.
12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）.
13、0.05mol/LNaOH.
14、DNA標(biāo)準(zhǔn)液：取標(biāo)準(zhǔn)DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中,再用0.05mol/LNaOH定容至25ml,后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中,加5.0ml1mol/LHClO4,混合冷卻后用0.5mol/LHClO4定容至刻度,則得100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液.
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、稱取植物幼嫩組織10g剪碎置研缽中,加10ml預(yù)冷研磨緩沖液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊狀.
2、將勻漿無損轉(zhuǎn)入25ml刻度試管中加入等體積的氯仿－異戊醇混合液,加上塞子,劇烈振蕩30s,轉(zhuǎn)入離心管,靜置片刻以脫除組織蛋白質(zhì).以4000rpm離心5min.
3、離心形成三層,小心地吸取上層清液至刻度試管中,棄去中間層的細(xì)胞碎片、變性蛋白質(zhì)及下層的氯仿.
4、將試管置72℃水浴中保溫3min（不超過4min）,以滅活組織的DNA酶,然后迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫,加5mol/L高氯酸鈉溶液〔提取液：高氯酸鈉溶液＝4：1（V／V）〕,使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L.
5、再次加入等體積氯仿－異戊醇混合液至大試管中,振蕩1min,靜置后在室溫下離心（4000rpm）5min,取上清液置小燒杯中.
6、用滴管吸95％的預(yù)冷乙醇,慢慢地加入燒杯中上清液的表面上,直至乙醇的體積為上清液的兩倍,用玻璃棒輕輕攪動(dòng).此時(shí)核酸迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上.
7、然后加入0.5ml左右的10×SSC,使最終濃度為1×SSC.
8、重復(fù)第6步驟和第7步驟即得到DNA的粗制品.
9、加入已處理的Rnase溶液,使其最后的作用濃度為50～70μg/ml,并在37℃水浴中保溫30min,以除去RNA.
10、加入等體積的氯仿－異戊醇混合液,在三角瓶中振蕩1min,再除去殘留蛋白質(zhì)及所加Rnase蛋白,室溫下以4000rpm離心5min,收集上層水溶液.
11、再按6、7步驟處理即可得到純化的DNA液.
植物DNA的CTAB提取法：
試驗(yàn)步驟：
1、稱取新鮮葉片2-3g,剪碎放入研缽中,在液氮中研磨成粉末.
2、將粉末轉(zhuǎn)移到加有7ml經(jīng)預(yù)熱的15×CTAB提取緩沖液15ml離心管中,迅速混勻后置于65℃水浴中,溫育30min.
3、取出離心管,冷卻至室溫,加入氯仿/異戊醇(24:1),充分混勻,室溫下2300轉(zhuǎn)離心20min.
4、將上清轉(zhuǎn)移至另一新的15ml離心管中,加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇.充分混勻,2300rpm離心20min.
5、轉(zhuǎn)移上清至另一新的15ml離心管中,加入等體積1%的CTAB沉淀緩沖液,輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉淀.1000rpm離心10min,使DNA沉淀于管底.
6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中過夜.
7、待DNA完全溶解后,加2-3ml4℃預(yù)冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀,挑出DNA,置于15ml離心管中,用70%乙醇清洗30min.
8、離心機(jī)甩5s,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5min,倒出95%乙醇,在超凈工作臺(tái)上吹干.
9、將風(fēng)干的DNA直接在4℃保存?zhèn)溆没蛉苡?00μlTE溶液中于-20℃保存.

細(xì)菌DNA的提取方法
針對(duì)一些不易于提取的細(xì)菌的方法:
試驗(yàn)試劑：
抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)
25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl
10MLiCl
2MLiCl
DEPC-water（抑制RNA酶活性）
3MNaAc(pH5.2)
96%乙醇
70%乙醇
試驗(yàn)步驟：
1、抽提緩沖液65℃預(yù)熱.
2、加菌體到已經(jīng)預(yù)熱的緩沖液（700ul）中混勻,65℃,10min.
3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）,振蕩,以12,000rpm,離心10min.
4、取上清,加氯仿/異戊醇（24：1）振蕩,以12,000rpm,離心10min.
5、重復(fù)再作一次步驟4.
6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇）,－20C下沉淀.
7、以2,000rpm,離心10min.
8、棄上清,以70％乙醇條洗沉淀,也可以再用100％乙醇洗,然后溶解于100ml水中.

較為常用的細(xì)菌DNA提取方法：
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)過夜.
2、取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min.
3、沉淀中加入567ul的TE緩沖液,反復(fù)吹打使之重新懸浮,加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K,混勻,于37℃溫育1h.
4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻,再加入80ulCTAB/NaCl溶液,混勻后再65℃溫育10min.
5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻,離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中,加入0.6-0.8倍體積的異丙醇,輕輕混合直到DNA沉淀下來,沉淀可稍加離心.
6、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇．

真菌DNA提取總結(jié)的兩種方法：
第一種方法：
試驗(yàn)步驟：
1、取真菌菌絲0.5g,在液氮中迅速研磨成粉.
2、加入4mL提取液,快速振蕩混勻.
3、加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1),渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚）.
4、以4℃,1000rpm,離心5min.
5、上清再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次.以4℃,10,000rpm,離心5min.
6、取上清,加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀,混勻,靜置約30min.
7、用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干,重懸于500ulTE中.
8、加入1ulRNaseA（10mg/mL）,37℃下處理1h.
9、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次.以4℃,10,000rpm,離心5min.
10、取上清,加入1/10倍體積的3MNaAc,2.5倍體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上.
11、沉淀用75%乙醇漂洗,風(fēng)干,溶于200ulTE中,-20℃保存?zhèn)溆?
DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5）,0.5MNaCl,0.01MEDTA,1％SDS,3MNaAc.
第二種方法：
試驗(yàn)步驟：
1、真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉.
2、加入3mL65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液,快速振蕩混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次.
3、加入1mL5MKAc,冰浴20min.
4、等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm,4℃離心5min）.
5、取上清,加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇,混勻,置約30min.
6、用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干,重懸于500ulTE中.
7、加入1ulRNaseA（10mg/mL）,37℃處理1h.
8、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次.以4℃,10,000rpm,離心5min.
9、取上清,1/10V3MNaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上.
10、沉淀用75%乙醇漂洗,風(fēng)干,溶于200ulTE中,-20℃保存?zhèn)溆?
植物基因組提取(CATB法)
作者：時(shí)間：2008-05-13 14:26:27來源:生物谷 瀏覽評(píng)論
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
掌握植物總DNA的抽提方法和基本原理.學(xué)習(xí)根據(jù)不同的植物和實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)和改良植物總DNA抽提方法.
二、實(shí)驗(yàn)原理
通常采用機(jī)械研磨的方法破碎植物的組織和細(xì)胞,由于植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對(duì)DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響,在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強(qiáng)還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性.在液氮中研磨,材料易于破碎,并減少研磨過程中各種酶類的作用.
十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethyl ammomum bromide,簡(jiǎn)稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡(jiǎn)稱SDS)等離子型表面活性劑,能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,從而使DNA得以游離出來.再加入苯酚和氯仿等有機(jī)溶劑,能使蛋白質(zhì)變性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很強(qiáng),經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì).上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物總DNA溶液.
三、實(shí)驗(yàn)材料
水稻幼葉
四、主要配方
2% CTAB抽提緩沖溶液: CTAB 4gNaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)0.5MEDTA 8ml,先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌, 冷卻后0.2-1% 2-巰基乙醇（400ul） 氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿,再加4ml異戊醇,搖勻即可.
五、實(shí)驗(yàn)步驟
1. DNA的提取
（1） 2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預(yù)熱.
（2）取少量葉片（約1g）置于研缽中,用液氮磨至粉狀；
（3） 加入700ul的2%CTAB抽提緩沖液,輕輕攪動(dòng)；
（4） 將磨碎液分倒入1.5 ml的滅菌中,磨碎液的高度約占管的三分之二；
（5）置于65℃的水浴槽或恒溫箱中,每隔10 min輕輕搖動(dòng),40 min后取出；
（6）冷卻2 min后,加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管,劇烈振蕩2~3 min,使兩者混合均勻；
（7）放入離心機(jī)中10 000 rpm離心10 min,與此同時(shí),將600 µl的異丙醇加入另一新的滅菌中；
（8） 10 000 rpm離心1 min后,移液器輕輕地吸取上清夜,轉(zhuǎn)入含有異丙醇的內(nèi),將離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)30 sec,使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；
（9）10000 rpm離心1 min后,立即倒掉液體,注意勿將白色DNA沉淀倒出,將離心管倒立于鋪開的紙巾上； （10）60 sec后,直立離心管,加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸鈉,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng),用手指彈管尖,使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中；
（11）放置30 min,使DNA塊狀物的不純物溶解；
（12）10000 rpm離心1 min后,倒掉液體,再加入800 µl 75%的乙醇,將DNA再洗 30 min；
（13）10000 rpm離心30 sec后,立即倒掉液體,將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后,直立離心管,干燥DNA（自然風(fēng)干或用風(fēng)筒吹干）；
（14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)緩沖液,使DNA溶解,置于37℃恒溫箱約15 h,使RNA消解；
（15）置于-20℃保存、備用.
2. DNA質(zhì)量檢測(cè)
瓊脂糖電泳檢測(cè),原理和方法見實(shí)驗(yàn)二.
六、 注意事項(xiàng)
（1）葉片磨得越細(xì)越好.
（2）移液器的使用.
（3）由于植物細(xì)胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作應(yīng)迅速,以免組織解凍,導(dǎo)致細(xì)胞裂解,釋放出DNA酶,使DNA降解.