當(dāng)紫外光或波長(zhǎng)較短的可見(jiàn)光照射到某些物質(zhì)時(shí),這些物質(zhì)會(huì)發(fā)射出各種顏色和不同強(qiáng)度的可見(jiàn)光,而當(dāng)光源停止照射時(shí),這種光線隨之消失.這種在激發(fā)光誘導(dǎo)下產(chǎn)生的光稱(chēng)為熒光,能發(fā)出熒光的物質(zhì)稱(chēng)為熒光物質(zhì).
分子的吸收光譜和產(chǎn)生熒光的機(jī)制：當(dāng)物質(zhì)分子吸收某些特征頻率的光子以后,可由基態(tài)躍遷至第一或第二電子激發(fā)態(tài)中各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)和各個(gè)不同轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí),如圖1中的a和b.處于激發(fā)態(tài)的分子通過(guò)無(wú)輻射弛豫（例如,與其它分子碰撞過(guò)程中消耗能量,或者,對(duì)分子組織而言,誘發(fā)光化反應(yīng)而消耗能量等）降落至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí),如圖1中c.然后再由這個(gè)最低振動(dòng)能級(jí)以輻射弛豫的形式躍遷到基態(tài)中各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí),發(fā)出分子熒光.然后再無(wú)輻射弛豫至基態(tài)中最低振動(dòng)能級(jí).
幾乎所有物質(zhì)分子都有吸收光譜,但不是所有物質(zhì)都會(huì)發(fā)熒光.產(chǎn)生熒光必須具備以下條件：①該物質(zhì)分子必須具有與所照射的光線相同的頻率,這與分子的結(jié)構(gòu)密切相關(guān).②吸收了與本身特征頻率相同的能量之后的物質(zhì)分子,必須具有高的熒光效率.許多吸光物質(zhì)并不產(chǎn)生熒光,主要是因?yàn)樗鼈儗⑺漳芰肯挠谂c溶劑分子或其它分子之間的相互碰撞中,還可能消耗于一次光化學(xué)反應(yīng)中,因而無(wú)法發(fā)射熒光,即熒光效率很低.
由熒光的發(fā)光原理可知,分子熒光光譜與激發(fā)光源的波長(zhǎng)無(wú)關(guān),只與熒光物質(zhì)本身的能級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān),所以,可以根據(jù)熒光譜線對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行定性分析鑒別.
照射光越強(qiáng),被激發(fā)到激發(fā)態(tài)的分子數(shù)越多,因而產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度越強(qiáng),測(cè)量時(shí)靈敏度越高.一般由激光誘導(dǎo)熒光測(cè)量物質(zhì)的特性比由一般光源誘導(dǎo)熒光所測(cè)的靈敏度提高2-10倍.
(2) 生物組織自體熒光的產(chǎn)生在大多數(shù)組織成分中,未染色和未使用熒光藥物的組織即有某種程度的熒光,這稱(chēng)為自體熒光或固有熒光、原發(fā)熒光.生物組織的自體熒光屬于分子熒光.在能量釋放過(guò)程中,生物組織通過(guò)三種方式消耗能量：熱消耗、熒光發(fā)射、在一個(gè)光化學(xué)反應(yīng)中被利用.在熱消耗過(guò)程中,光線僅僅被吸收而無(wú)熒光產(chǎn)生；在光誘發(fā)的光化學(xué)反應(yīng)表現(xiàn)為褪色.所以,生物組織的自體熒光是與熱消耗和光化學(xué)反應(yīng)相互競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果,哪一種情況的發(fā)生率高,則哪一種情況占主導(dǎo)地位.
生物大分子發(fā)射熒光的基本原理中,無(wú)輻射弛豫包括振動(dòng)弛豫、內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換和碰撞交換能量馳豫；輻射馳豫則有彈性散射和發(fā)射熒光兩種方式.因而自身的振動(dòng)和與周邊分子的相互作用,生物大分子的能級(jí)（基態(tài)和激發(fā)態(tài)）都被展寬,所以熒光光譜較寬.
實(shí)際上,探測(cè)器接收到的生物組織發(fā)出的自體熒光是激發(fā)光特性（功率、波長(zhǎng)、激發(fā)光輸出端的幾何結(jié)構(gòu)）、組織內(nèi)熒光物質(zhì)的含量與特性、其它物質(zhì)對(duì)熒光的吸收與散射特性、熒光接收端的幾何與光學(xué)特性等等諸多因素的綜合效果.