1 色譜條件的確定
專屬性是色譜條件建立的關鍵通常是采用
在被測物對照品(或供試品)中加入適量的雜質(zhì)或輔
料以驗證所選色譜條件能否將各雜質(zhì)與被測物
分離檢出
[2]
.應按1(w/w)被測物濃度的各雜質(zhì)量
添加至被測物中模擬被測物中可能存在雜質(zhì)的
狀態(tài)即有少量(約1)雜質(zhì)存在時能否與被測物
達到完全分離(分離度大于1.5)以驗證系統(tǒng)適用
性.只有這樣才能較為客觀、科學地反映被測物的
實際情況.而不應將被測物與各雜質(zhì)配制成相同濃
度的溶液因為實際檢測中不可能存在這種情況
且該濃度也不易確定.在實際檢測時由于被測物
濃度較大很易將相鄰雜質(zhì)峰包含其中.另外還需
測定溶劑和輔料(檢測制劑時)是否有干擾.目前
美國藥典(USP)、英國藥典(BP)及許多進口產(chǎn)品的
質(zhì)量標準中有關物質(zhì)測定方法學的專屬性驗證均
采用此法.還須說明的是雜質(zhì)與雜質(zhì)峰間的分離
度達1.2即可而被測物與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度
必須大于1.5.
2 檢測波長的選擇
有關物質(zhì)檢測的研究對象是雜質(zhì)而非被測
物.但測定則是通過各自的峰面積來表達故波長
的選擇必須考慮被測物和各雜質(zhì)在檢測波長下的校
正因子(f)是否相同.應分別制備相同濃度的被測
物與各雜質(zhì)溶液經(jīng)紫外掃描后以吸光度相近的波
長為檢測波長.在該檢測波長下分別進樣測定
由各峰面積計算校正因子.若f為0.81.2則表明
被測物與各雜質(zhì)的f相同可消除f的影響.若f≤0.8
或f ≥1.2則應在計算時加入f.目前通常以被測物
的最大吸收波長為檢測波長、不加校正因子的計算
方法而未綜合考慮各雜質(zhì)的f.
3 供試品溶液濃度的確定
供試品溶液濃度的確定也非常重要.雖然濃度
越高越能反映被測物中雜質(zhì)存在的情況但若設定
過高會產(chǎn)生主峰嚴重拖尾、裂峰、柱超載和檢測器超載等情況若設定過低則靈敏度不夠無法
檢測雜質(zhì)及其含量變化.
最低檢出濃度的測定可分為信噪比法和直接評
價法兩種
[3]
.后法是目前較為科學的做法即將儀
器的靈敏度調(diào)至較適宜的值(僅對靈敏度可調(diào)節(jié)的
儀器而言目前市場上主流品牌的液相色譜儀均已
設定了一個恒定、較為靈敏的值)然后將被測物
溶液不斷稀釋后進樣測定直至被測物峰面積無法
檢出為止此時的濃度即為最低檢出濃度.
最大進樣量則是采用不斷增加被測物溶液濃
度直至峰嚴重拖尾、裂峰、柱超載和檢測器超載
等情況出現(xiàn).
根據(jù)最低檢出濃度采用“上推法”來確定
供試品溶液濃度如一般設定雜質(zhì)總量小于1.0
對照液對照溶液的濃度至少應為最低檢出濃度的
2050倍供試品溶液濃度則應是最低檢出濃度的
20005000倍.同時還應考慮儀器、色譜柱等因
素對最低檢出濃度和最大進樣濃度的影響(即耐用
性因素)所以供試品溶液的濃度應在保證小于最
大進樣量的情況下適當設定得高些以保證該濃
度在任何試驗條件下均有足夠的檢測靈敏度.表
1為最低檢出濃度、最大進樣量、供試品溶液和對
照溶液間的比例關系(進樣量10µl規(guī)定雜質(zhì)限度
1.0).
4 線性試驗
在穩(wěn)定性考察中如某雜質(zhì)含量不斷增加
則說明被測物降解的途徑穩(wěn)定、可循則有必要對
該雜質(zhì)進行針對性地監(jiān)控即采用該雜質(zhì)對照品
(經(jīng)確證結構后由人工合成獲得)以外標法準確測
定.此時與含量測定相似應進行線性試驗.
通常將雜質(zhì)限度設定為該雜質(zhì)的100濃度線性
驗證范圍10150(即相當于被測物測定濃度
表1 最低檢出量、最大進樣量、供試品溶液和對照
溶液間的比例關系
參數(shù)濃度/µg·ml
–
1
絕對量/ng相當于供試品
溶液濃度/與最低檢出
濃度的倍數(shù)
最大進樣量3000
最低檢出濃度0.110.02
供