（一）脾細(xì)胞 1．材料 (1)免疫過(guò)的血清抗體滴度高的Balb/c鼠.(2)1640培養(yǎng)液 單克隆抗體制備流程
(3)2.5％FCS－1640營(yíng)養(yǎng)液 2．操作方法 (1)拉頸或用CO2處死小白鼠.(2)將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在無(wú)菌條件下取脾.(3)把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中,冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球.(4)用鑷子輕輕擠壓脾,做成脾細(xì)胞懸液,用毛細(xì)管將懸液移入小試管中.(5)直立小試管3min,使大塊的結(jié)締組織下沉,把細(xì)胞懸液移入離心管中.(6)以2.5％FCS—1640充滿離心管,并以400g離心7min～10min（與此同時(shí)應(yīng)開(kāi)始制備骨髓細(xì)胞）.(7)把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮.(8)重復(fù)⑹、⑺步驟.(9)計(jì)算細(xì)胞,以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查,活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格.（二）骨髓瘤細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白,這樣的瘤細(xì)胞融合后,可能影響或降低所分泌抗體的滴度,所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞.選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：①該瘤細(xì)胞系的來(lái)源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系,以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài),不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細(xì)胞外；③骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)較高的細(xì)胞密度,最好106個(gè)細(xì)胞/ml；④生長(zhǎng)速度快,繁殖時(shí)間短.常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（簡(jiǎn)稱SP2）；③P2—X­—Ag8·6·5·3（簡(jiǎn)稱653）；④FO以653最為常用,它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane,降植烷）誘發(fā)出來(lái)的一種漿細(xì)胞瘤（MinerolOilplasmacytoma,MOPC）并經(jīng)過(guò)培育形成一株8-氮鳥(niǎo)嘌呤有抵抗力的亞系.骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可.由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài),很容易脫落,因此不需要胰酶處理.為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象,在融合前,可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml8－氮鳥(niǎo)嘌呤.取約1×107～6×107對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（即培養(yǎng)15h～20h）的骨髓瘤細(xì)胞,在室溫離心（400g）10min,沉淀以2.5％FCS—1640液再懸浮并計(jì)數(shù).（三）飼養(yǎng)細(xì)胞 在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中,單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖,必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖,加入的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feedercell）.在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過(guò)程中,就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長(zhǎng)繁殖成群體,因此在這一過(guò)程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞.許多種類(lèi)的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞,如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等,常選用腹腔滲出細(xì)胞,其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞.應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞,另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片,為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成良好的環(huán)境.腹腔細(xì)胞的來(lái)源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠.也可以是其他種類(lèi)的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等.1．材料 （1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只.（2）11.6％蔗糖溶液（經(jīng)10磅30min高壓滅菌）.2．操作方法 （1）拉頸處死小鼠.（2）70％酒精浸泡消毒10min.（3）用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開(kāi)一小口,剝開(kāi)皮膚,露出腹腔.（4）用注射器將4ml11.6％蔗糖溶液注入腹腔,用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體,加入離心管.（5）1000r／min離心10min.（6）取上清,以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液.臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞,使每毫升含40萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞.（7）以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿,每孔0.05ml,含2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),即可供細(xì)胞融合和克隆化之用.如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少,則可以在細(xì)胞換液時(shí)再加入一些.