本人看了很多論壇和資料,大多的elisa都是測(cè)未知抗原和抗體,因?yàn)槲沂菑闹参飪?nèi)混合蛋白質(zhì)中測(cè)出目的蛋白的濃度,我們目前有需檢測(cè)蛋白的相關(guān)抗原、自己免疫的多克隆的一抗和HRP-標(biāo)記的二抗,是不是我們包被的時(shí)候用包被液倍比稀釋抗原,并將需檢測(cè)的蛋白也按照設(shè)定的1:20、1:40、1:80、1:160稀釋后一起包被過(guò)夜?
我在想我是不是可以認(rèn)定我們有的這個(gè)抗原則為我們的標(biāo)準(zhǔn)品,然后來(lái)檢測(cè)我們的蛋白.不甚感激~
我們目前的設(shè)計(jì)流程是：
1.包被抗原和待測(cè)蛋白 4℃過(guò)夜
（抗原按照倍比稀釋加入包被液為:10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.15625,0 單位是μg/ml 蛋白1:100稀釋都加入)
2.第二天棄液,PBST洗板3次,拍干
3.每孔加入3％BSA封閉至滿(mǎn)孔,37℃濕盒濕育 2h
4.洗版,
5.每孔加入稀釋好的一抗（1:80）100μl,37℃濕盒濕育 2h
6.洗版,
7.每孔加入辣根酶標(biāo)記的IgG(1:1000)100ul,37℃濕盒濕育 1h
8.
9.每孔加入100ul底物反應(yīng)液（現(xiàn)用現(xiàn)配）暗反應(yīng)15min
10.加入50μl 2MH2SO4 停止反應(yīng)上機(jī)在450nm下測(cè)標(biāo)曲并讀值.
目前的問(wèn)題是：如何能確定我們蛋白的最佳稀釋濃度,和一二抗的最佳工作濃度?