物根系是活躍的吸收器官和合成器官,根的生長情況和活力水平直接影響地上部的營養(yǎng)狀況及產量水平.本實驗練習測定根系活力的方法,為植物營養(yǎng)研究提供依據.
一、原理
氯化三苯基四氮唑（TTC）是標準氧化電位為80 mV的氧化還原色素,溶于水中成為無色溶液,但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲 （TTF）,如下式：
生成的三苯甲 （TTF）比較穩(wěn)定,不會被空氣中的氧自動氧化,所以TTC被廣泛用作酶試驗的氫受體,植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸得到增強,而被丙二酸、碘乙酸所抑制.所以TTC還原量能表示脫氫酶活性,并作為根系活力的指標.
二、實驗材料、試劑與儀器設備
（一）實驗材料
水培或砂培小麥、玉米等植物根系.
（二）試劑
1.乙酸乙酯（分析純）.
2.次硫酸鈉（Na2S2O4,分析純）,粉末.
3.1％TTC溶液：準確稱取TTC 1.0 g,溶于少量水中,定容到100 mL.用時稀釋至需要的濃度.
4.磷酸緩沖液（1/15 mol/L,pH7.0）.
5.1 mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的濃硫酸55 mL,邊攪拌邊加入盛有500 mL蒸餾水的燒杯中,冷卻后稀釋至1000 mL.
6.0.4 mol/L琥珀酸：稱取琥珀酸4.72 g,溶于水中,定容至100 mL即成.
（三）儀器設備
小燒杯3個,研缽1個,移液管：0.5 mL 1支、10 mL 1支、5 mL 3支,刻度試管6支,分光光度計,分析天平（感量0.1 mg）,電子頂載天平（感量0.1 g）,溫箱,試管架,藥勺,石英砂適量,濾紙.
三、實驗步驟
1.定性測定
（1）配制反應液 把1％ TTC溶液、0.4 mol／L的琥珀酸和磷酸緩沖液按1:5:4比例混合.
（2）把根仔細洗凈,把地上部分從莖基部切除.將根放入三角瓶中,倒入反應液,以浸沒根為度,置37℃左右暗處放1～3 h,以觀察著色情況,新根尖端幾毫米以及細側根都明顯地變成紅色,表明該處有脫氫酶存在.
2.定量測定
（1）TTC標準曲線的制作 取0.4％ TTC溶液0.2 mL放入大試管中,加9.8 mL乙酸乙酯,再加少許Na2S2O4粉末搖勻,則立即產生紅色的TTF.此溶液濃度為每毫升含有TTF 80 µg.分別取此溶液0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL置10 mL刻度試管中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含TTF 20 µg、40 µg、80 µg、120 µg、160 µg的系列標準溶液,以乙酸乙酯作參比,在485 nm波長下測定吸光度,繪制標準曲線.
（2）稱取根尖樣品0.5 g,放入小燒杯中,加入0.4％ TTC溶液和磷酸緩沖液（pH7.0）各5 mL,使根充分浸沒在溶液內,在37℃下暗保溫1～2 h,此后立即加入1 mol/L硫酸2 mL,以停止反應.（與此同時做一空白實驗,先加硫酸,再加根樣品,37℃下暗保溫后不加硫酸,其溶液濃度、操作步驟同上）.
（3）把根取出,用濾紙吸干水分,放入研缽中,加乙酸乙酯3～4 mL,充分研磨,以提出TTF.把紅色提取液移入刻度試管,并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌2～3次,皆移入刻度試管,最后加乙酸乙酯使總量為10 mL,用分光光度計在波長485 nm下比色,以空白試驗作參比測出吸光度,查標準曲線,即可求出TTC還原量.
四、結果計算
根系活力= C/(1000*W*h) [mg TTF/（g•h）]
式中：C——四氮唑還原量,μg.
W——根重,g.
h——時間,h.