枯草芽孢桿菌常用培養(yǎng)基配方：
1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏+20g瓊脂
枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備
1 培養(yǎng)枯草芽孢桿菌
取親本菌株T4412、TT2 新鮮斜面分別接一環(huán)到裝有液體完全培養(yǎng)基(CM)的試管中,36℃振蕩培養(yǎng)14 h,各取1 mL 菌液轉(zhuǎn)接入裝有20 mL 液體完全培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中,36℃振蕩培養(yǎng) 3 h,使細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)前期,各加入25 u/mL 青霉素,使其終濃度為0.3 u/mL,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2 h.
2. 收集細(xì)胞
各取菌液10 mL,4000 r/min 離心10 min,棄上清液,將菌體懸浮于磷酸緩沖液中,離心.如此洗滌兩次,將菌體懸浮10 mL SMM 中,每mL 約含108～109 活菌為宜.
3. 總菌數(shù)測(cè)定
各取菌液0.5 mL,用生理鹽水稀釋,取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀釋度作兩個(gè)平板)、傾注完全培養(yǎng)基,36℃培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù).此為未經(jīng)酶處理的總菌數(shù).
4. 脫壁
二株親本菌株各取5 mL 菌懸液,加入5 mL 溶菌酶溶液,溶菌酶濃度為100 ug/mL,混勻后于36℃水浴保溫處理30 min,定時(shí)取樣,鏡檢觀察原生質(zhì)體形成情況,當(dāng)95%以上細(xì)胞變成球狀原生質(zhì)體時(shí),用4000 r/min 離心10 min,棄上清液,用高滲緩沖液洗滌除酶,然后將原生質(zhì)體懸浮于5 mL 高滲緩沖液中.立即進(jìn)行剩余菌數(shù)的測(cè)定.
5. 剩余菌數(shù)測(cè)定
取0.5 mL 上述原生質(zhì)體懸液,用無(wú)菌水稀釋,使原生質(zhì)體裂解死亡,取10-2、10-3、10-4 稀釋液各0.1 mL,涂布于完全培養(yǎng)基平板上,36℃培養(yǎng)24～48 h,生長(zhǎng)出的菌落應(yīng)是未被酶裂解的剩余細(xì)胞.
計(jì)算酶處理后剩余細(xì)胞數(shù),并分別計(jì)算二親株的原生質(zhì)體形成率.原生質(zhì)體形成率＝未經(jīng)酶處理的總菌數(shù)一酶處理后剩余細(xì)胞數(shù).