濃縮膠的作用原理
不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)之一是可以使用稀樣品.這是因?yàn)樵跇悠愤M(jìn)入分離膠以前,先經(jīng)過(guò)大孔徑濃縮膠的遷移作用而被 濃縮至一極窄的區(qū)帶.其作用原理是在緩沖系統(tǒng)中的弱酸,如甘氨酸,在接近其pKa的pH值時(shí),任何時(shí)候都只有一部分分子帶負(fù)電.如樣品和濃縮膠均用pH 6.7的Tris-HCI緩沖液,電極液用Tris-甘氨酸緩沖液.此時(shí),甘氨酸很少解離,其有效泳動(dòng)率很低,而氯離子卻有很高的泳動(dòng)率,蛋白質(zhì)分子的泳動(dòng)率介于氯離子和甘氨酸之間.一旦加上電壓,作為先導(dǎo)離子的氯離子和作為尾隨離子的甘氨酸離子分離開(kāi)來(lái),并在其后面留下一個(gè)導(dǎo)電性較低的區(qū)帶.由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比,這一區(qū)帶便獲得較高的電壓梯度,并加速甘氨酸的泳動(dòng),使其趕上氯離子, 建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動(dòng)率乘積的相等的穩(wěn)定態(tài),使這些帶電顆粒以相同速度泳動(dòng),兩種離子之間具有明顯的邊界.當(dāng)甘氨酸、氯離子界面通過(guò)樣品進(jìn)入濃縮膠時(shí),在移動(dòng)界面前有一低電壓梯度,在界面后有一高電壓梯度.由于在移動(dòng)界面前的蛋白質(zhì)泳動(dòng)速度比氯離子低,因此氯離子能迅速越過(guò).移動(dòng)界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中,其泳動(dòng)速度比甘氨酸快.因此,移動(dòng)的界面將蛋白質(zhì)分子堆積到一起,濃縮為一狹窄的區(qū)帶.蛋白質(zhì)在移動(dòng)界面中的濃縮作用僅取決于樣品和濃縮膠中的Tris-HCI的濃度,而與樣品中蛋白質(zhì)的最初濃度無(wú)關(guān).由于濃縮膠為大孔凝膠,故對(duì)樣品沒(méi)有分子篩作用.當(dāng)移動(dòng)的界面到達(dá)濃縮膠和分離膠的界面時(shí),凝膠的pH值明顯增加,并導(dǎo)致甘氨酸的大量解離.此時(shí)甘氨酸的有效泳動(dòng)率增加,使它越過(guò)蛋白質(zhì)并直接在氯離子后移動(dòng).同時(shí)由于凝膠孔徑變小,使蛋白質(zhì)分子的遷移率減小.于是蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和pH值中泳動(dòng),并根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離.