氯仿是分子量比較大的有機(jī)溶劑,在提取RNA時(shí),氯仿可以有效的使有機(jī)相和無機(jī)相迅速分離.DNA提取過程 有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合,從而使得蛋白和DNA脫離,DNA進(jìn)入水相.但是在RNA的提取過程就要避免蛋白和DNA脫離,否則DNA會(huì)釋放到水相.不管有酚也好,沒有酚也好,氯仿本身也對(duì)蛋白有變性作用,劇烈的震蕩,很容易使得DNA的親水基團(tuán),與水相接觸.所以不要?jiǎng)×艺鹗?
異丙醇的作用是通過-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA鏈中的親水基團(tuán)受到保護(hù),等同于沉淀,但是這是個(gè)反應(yīng)時(shí)發(fā)生在水相中,與前面的氯仿不矛盾.
氯仿的作用有多個(gè)方面,一是作為有機(jī)溶劑變性蛋白,使其沉淀并通過離心除去,同時(shí)也通過變性作用抑制RNase活性；二是RNA提取試劑中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚,很多自己配試劑提的方法也用苯酚,抽提蛋白時(shí)也會(huì)用到苯酚）,苯酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去會(huì)損傷核酸,需要通過氯仿把水相里參與的苯酚抽提掉；三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)（比如油脂、脂溶性色素等）,起到一定除雜作用
通常氯仿里面會(huì)加少量異戊醇（1/25）,減少蛋白質(zhì)在變性過程中由于震蕩產(chǎn)生的泡沫,影響后續(xù)操作,不過個(gè)人經(jīng)驗(yàn)感覺加不加沒什么太大區(qū)別,也許是我的樣品里蛋白不多吧
異丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一樣.只不過用量少一點(diǎn),0.6V~1V就夠了,不像乙醇沉淀需要至少2V,一般需要2.5倍體積.在水相很多,離心管容積有限,加不下太多乙醇的時(shí)候一般會(huì)用異丙醇沉淀.不過感覺效果不如乙醇,偶爾會(huì)有沉淀不出來東西的時(shí)候