限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）:識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶.
[別名] Endodeoxyribonuclease
[酶反應(yīng)] 限制性內(nèi)切酶能分裂DNA分子在一限定數(shù)目的專一部位上.它能識(shí)別外源DNA并將其降解.
[單位定義] 在指明pH與37℃,在0.05mL反應(yīng)混合物中,1小時(shí)消化1μg的λDNA的酶量為1單位.
[性狀] 制品不含非專一的核酸水解酶(由10單位內(nèi)切酶與1μg λDNA,保溫16小時(shí)所得的凝膠電泳圖譜的穩(wěn)定性表示).
限制性核酸內(nèi)切酶的命名；一般是以微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母組成,第四個(gè)字母表示菌株(品系).例如,從Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性內(nèi)切酶稱為Bam H,在同一品系細(xì)菌中得到的識(shí)別不同堿基順序的幾種不同特異性的酶,可以編成不同的號(hào),如HindII、HindIII,HpaI、HpaII,MboI、MboI等.
在生物體內(nèi)有一類酶,它們能將外來的DNA切斷,即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力,但對(duì)自己的DNA卻無損害作用,這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息.由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的,故名限制性內(nèi)切酶(簡(jiǎn)稱限制酶).限制酶是基因工程中所用的重要切割工具.科學(xué)家已從原核生物中分離出了許多種限制酶,并且已經(jīng)商品化,在基因工程中廣泛使用.根據(jù)限制酶切割的特點(diǎn),可將它們分為兩大類：一類是切割部位無特異性的；另一類是可特異性地識(shí)別核苷酸序列,即只能在一定的DNA序列上進(jìn)行切割.這種能被特異性識(shí)別的切割部位都具有回文序列,也就是在切割部位,一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致.在基因工程中使用的多數(shù)是后一類酶.限制酶在特定切割部位進(jìn)行切割時(shí),按照切割的方式,又可以分為錯(cuò)位切和平切兩種.錯(cuò)位切一般是在兩條鏈的不同部位切割,中間相隔幾個(gè)核苷酸,切下后的兩端形成一種回文式的單鏈末端,這個(gè)末端能與具有互補(bǔ)堿基的目的基因的DNA片段連結(jié),故稱為黏性末端.這種酶在基因工程中應(yīng)用最多.另一種是在兩條鏈的特定序列的相同部位切割,形成一個(gè)無黏性末端的平口.
在基因操作過程中,除了限制酶以外,還要用一系列的酶類,才能完成全過程.例如,堿性磷酸酯酶、DNA多聚酶、末端轉(zhuǎn)移酶、多核苷酸酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等.這些酶都有各自特殊的催化功能,現(xiàn)在都有商品出售,可以根據(jù)不同的需要選用.
簡(jiǎn)短定義：
DNA限制性內(nèi)切酶：
生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶.它可以將外來的DNA切斷的酶,即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力,但對(duì)自己的DNA卻無損害作用,這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息.由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的,故名限制性內(nèi)切酶(簡(jiǎn)稱限制酶).
限 制 性 內(nèi) 切 酶 綜 述
(Restriction Endonucleases: An Overview)
30多年前,當(dāng)人們?cè)趯?duì)噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時(shí),首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶.細(xì)菌可以抵御新病毒的入侵,而這種"限制"病毒生存的辦法則可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源DNA的限制性內(nèi)切酶.首批被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶包括來源于大腸桿菌的EcoR I和EcoR II,以及來源于Haemophilus influenzae的Hind II和Hind III.這些酶可在特定位點(diǎn)切開DNA,產(chǎn)生可體外連接的基因片段.研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達(dá)非常有用的工具.
當(dāng)限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用在上世紀(jì)七十年代流傳開來的時(shí)候,以NEB為代表的許多公司開始尋找更多的限制性內(nèi)切酶.除了某些病毒以外,限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)現(xiàn).人們正在從數(shù)以千計(jì)的細(xì)菌及古細(xì)菌中尋找新的限制性內(nèi)切酶.而對(duì)已測(cè)序的原核基因組數(shù)據(jù)分析表明,限制性內(nèi)切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存的細(xì)菌和古細(xì)菌似乎都能編碼限制性內(nèi)切酶.
限制性內(nèi)切酶的形式多樣,從大小上來說,它們可以小到如Pvu II（157個(gè)氨基酸）,也可以比1250個(gè)氨基酸的Cje I更大.在已純化分類的3000種限制性內(nèi)切酶中,已發(fā)現(xiàn)了超過250種的特異識(shí)別序列.其中有30%是在NEB發(fā)現(xiàn)的.對(duì)具有未知特異識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶的研究發(fā)現(xiàn)工作仍在繼續(xù).人們從分析細(xì)胞提取物的生化角度研究的同時(shí),也采用計(jì)算機(jī)分析已知的基因組數(shù)據(jù),以期有更多的發(fā)現(xiàn).盡管很多新發(fā)現(xiàn)的酶的識(shí)別序列與已有的重復(fù)--即同裂酶,仍然有識(shí)別新位點(diǎn)的酶不斷被發(fā)現(xiàn).
上世紀(jì)80年代,NEB開始克隆并表達(dá)限制性內(nèi)切酶.克隆技術(shù)由于將限制性內(nèi)切酶的表達(dá)與原有細(xì)胞環(huán)境分離開來,避免了原細(xì)胞中其它內(nèi)切酶的污染,從而提高了酶的純度.此外,克隆技術(shù)提高了限制性內(nèi)切酶的產(chǎn)量,簡(jiǎn)化了純化過程,使得生產(chǎn)成本顯著降低；克隆的基因很容易進(jìn)行測(cè)序分析,表達(dá)出的蛋白也能進(jìn)行X射線結(jié)晶分析,這使得我們對(duì)于克隆產(chǎn)物更加確定.
限制性內(nèi)切酶 一、限制與修飾（Restriction and modification）
1．限制與修飾現(xiàn)象
早在 50 年代初,有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)了限制與修飾現(xiàn)象,當(dāng)時(shí)稱作寄主控制的專一性（host controlled specificity）. l 噬菌體表現(xiàn)的現(xiàn)象便具有代表性和普遍性,其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率可說明這一問題（表 2-1）. l 在感染某一宿主后,再去感染其它宿主時(shí)會(huì)受到限制.
E.coli 菌株 λ噬菌體感染率
lK lB lC
E.coli K 1 10-4 10-4
E.coli B 10-4 1 10-4
E.coli C 1 1 1
說明 K 和 B 菌株中存在一種限制系統(tǒng),可排除外來的 DNA . 10-4 的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果,此時(shí)限制系統(tǒng)還未起作用.而在 C 菌株不能限制來自 K 和 B 菌株的 DNA .限制作用實(shí)際就是限制酶降解外源 DNA ,維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制.甲基化是常見的修飾作用,可使腺嘌呤 A 成為 N6 甲基-腺膘呤,胞嘧啶 C 成為 5' 甲基胞嘧啶.通過甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的.
2．限制酶的發(fā)現(xiàn)
在 20 世紀(jì) 60 年代,人們就注意到 DNA 在感染宿主后會(huì)被降解的現(xiàn)象,從而提出限制性切酶和限制酶的概念. 1968 年,首次從 E.coli K 中分離到限制酶,它有特定的識(shí)別位點(diǎn)但沒有特定的切割位點(diǎn),其中切割位點(diǎn)離識(shí)別位點(diǎn)達(dá) 1000bp 以上.
1970 年,美國約翰·霍布金斯大學(xué)的 H. Smith 于偶然中發(fā)現(xiàn),流感嗜血桿菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌體 DNA ,其細(xì)胞提取液可降解 E.coli DNA ,但不能降解自身 DNA ,從而找到 HindⅡ 限制性內(nèi)切酶. HindⅡ 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和切割位點(diǎn)如下：
5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '
3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
從此以后,發(fā)現(xiàn)的限制酶越來越多,并且許多已經(jīng)在實(shí)踐中得到應(yīng)用. EcoRⅠ 是應(yīng)用最廣泛的限制性內(nèi)切酶,酶切位點(diǎn)和切割位點(diǎn)如下：
5' G↓AATTC 3'
3' CTTAA↑G 5'
限制性內(nèi)切酶的命名遵循一定的原則,主要依據(jù)來源來定,涉及宿主的種名、菌株號(hào)或生物型.命名時(shí),依次取宿主屬名第一字母,種名頭兩個(gè)字母,菌株號(hào),然后再加上序號(hào)（羅馬字）.如 HindⅢ 限制性內(nèi)切酶, Hin 指來源于流感嗜血桿菌, d 表示來自菌株 Rd , Ⅲ 表示序號(hào).以前在限制性內(nèi)切酶和修飾酶前加 R 或 M ,且菌株號(hào)和序號(hào)小寫.但現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶名稱中的 R 省略不寫.
1986 年下半年發(fā)現(xiàn) 615 種限制酶和 98 種甲基化酶； 1998 年發(fā)現(xiàn) 10000 種細(xì)菌或古細(xì)菌中存在 3000 種酶,且酶有 200 多種特異性.到 2005 年 1 月,共發(fā)現(xiàn) 4342 種限制酶和甲基化酶,其中限制酶有 3681 種,包括 Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 種,甲基化指導(dǎo)的限制酶有 3 種,商業(yè)化的限制酶有 588 種,在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 種特異性.
3．限制與修飾系統(tǒng)的種類
根據(jù)酶的亞單位組成、識(shí)別序列的種類和是否需要輔助因子,限制與修飾系統(tǒng)至少可分為四類.表 2-2 是各種限制與修飾系統(tǒng)的比較.
Ⅱ 型（type Ⅱ）限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大,達(dá) 93% . Ⅱ 型酶相對(duì)來說最簡(jiǎn)單,它們識(shí)別回文對(duì)稱序列,在回文序列內(nèi)部或附近切割 DNA ,產(chǎn)生帶 3'- 羥基和 5'- 磷酸基團(tuán)的 DNA 產(chǎn)物,需 Mg2+ 的存在才能發(fā)揮活性,相應(yīng)的修飾酶只需 SAM .識(shí)別序列主要為 4-6bp ,或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列,但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列,切割位置因酶而異,有些是隔開的.
Ⅱs 型（type Ⅱs）限制與修飾系統(tǒng),占 5% ,與 Ⅱ 型具有相似的輔因子要求,但識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱,也是非間斷的,長(zhǎng)度為 4-7bp ,切割位點(diǎn)可能在識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的 20bp 范圍內(nèi).
Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚體（homodimer）,由兩個(gè)彼此按相反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成,每個(gè)亞單位作用在 DNA 鏈的兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)上.修飾酶是單體,修飾作用一般由兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶來完成,分別作用于其中一條鏈,但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的.
在 Ⅱ 型限制酶中還有一類特殊的類型,該酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈,造成一個(gè)切口,這類限制酶也稱切口酶 （nicking enzyme）,如 N.Bst NBI .
Ⅰ 型（type Ⅰ）限制與修飾系統(tǒng)的種類很少,只占 1% ,如 EcoK 和 EcoB .其限制酶和甲基化酶 （即 R 亞基和 M 亞基） 各作為一個(gè)亞基存在于酶分子中,另外還有負(fù)責(zé)識(shí)別 DNA 序列的 S 亞基,分別由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因編碼,屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位）. EcoK 編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M2S . EcoB 編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M4S2 .
EcoB 酶的識(shí)別位點(diǎn)如下,其中兩條鏈中的 A 為甲基化位點(diǎn), N 表示任意堿基.
TGA*（N）8TGCT
EcoK 酶的識(shí)別位點(diǎn)如下,其中兩條鏈中的 A 為可能的甲基化位點(diǎn).
AA°C（N）6GTGC
但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn) 1000bp 以外,且無特異性.
Ⅲ 型（type Ⅲ）限制與修飾系統(tǒng)的種類更少,所占比例不到 1% ,如 EcoP1 和 EcoP15 .它們的識(shí)別位點(diǎn)分別是 AGACC 和 CAGCAG ,切割位點(diǎn)則在下游 24-26bp 處.
在基因操作中,一般所說的限制酶或修飾酶,除非特指,均指 Ⅱ 型系統(tǒng)中的種類.
表2-2：各種限制與修飾系統(tǒng)的比較
Ⅱ Ⅰ Ⅲ
酶分子
內(nèi)切酶與甲基化酶
分子不在一起
三亞基雙功能酶
二亞基雙功能酶
識(shí)別位點(diǎn)
4-6bp, 大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)
二分非對(duì)稱
5-7bp 非對(duì)稱
切割位點(diǎn) 在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)別位點(diǎn)
無特異性,至少在識(shí)別位點(diǎn)外 1000bp
在識(shí)別位點(diǎn)下游 24-26bp
限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)
分開的反應(yīng)
互斥
同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)
限制作用是否需用 ATP
No
Yes
Yes
二、限制酶識(shí)別的序列
1．限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度
限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度一般為 4-8 個(gè)堿基,最常見的為 6 個(gè)堿基（表2-3）.當(dāng)識(shí)別序列為 4 個(gè)和 6 個(gè)堿基時(shí),它們可識(shí)別的序列在完全隨機(jī)的情況下,平均每 256 個(gè)和 4096 個(gè)堿基中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)（4^4=256,4^6=4096）.以下是幾個(gè)有代表性的種類,箭頭指切割位置.
4 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：Sau3AⅠ ↓GATC
5 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅡ ↓CCWGG
NciⅠ CC↓SGG
6 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅠ G↓AATTC
HindⅢ A↓AGCTT
7 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：BbvCⅠ CC↓TCAGC
PpuMⅠ RG↓GWCCY
8 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：NotⅠ GC↓GGCCGC
SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC
以上序列中部分字母代表的堿基如下.
R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C
K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T
H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G
D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T
2．限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)
限制酶識(shí)別的序列大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu),切割位點(diǎn)在 DNA 兩條鏈相對(duì)稱的位置. EcoRⅠ 和 HindⅢ 的識(shí)別序列和切割位置如下.
EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT
CTTAA↑G TTCGA↑A
有一些限制酶的識(shí)別序列不是對(duì)稱的,如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）].識(shí)別序列后面括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示在兩條鏈上的切割位置.
AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG
GGC↑GAG GAGCA↑C
有一些限制酶可識(shí)別多種序列,如 AccⅠ 識(shí)別的序列是 GT↓MKAC ,也就是說可識(shí)別 4 種序列,其中兩種是對(duì)稱的,另兩種是非對(duì)稱的. HindⅡ 識(shí)別的序列是 GTY↓RAC .
有一些限制酶識(shí)別的序列呈間斷對(duì)稱,對(duì)稱序列之間含有若干個(gè)任意堿基.如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ,它們的識(shí)別序列如下.
AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG
GT↑CNNNGAC GANT↑C
3．限制酶切割的位置
限制酶對(duì) DNA 的切割位置大多數(shù)在內(nèi)部,但也有在外部的.在外部的,又有兩端、兩側(cè)和單側(cè)之別.切點(diǎn)在兩端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在兩側(cè)的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ（CASTGNN↓）, BcgⅠ 酶的切割特性與其它酶不同,它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)的兩端各切開一個(gè)斷點(diǎn),而不是只產(chǎn)生一個(gè)斷點(diǎn).切點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)外側(cè)的還有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等.
BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓
↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ ↑NNGTG（C）ACNN
三、限制酶產(chǎn)生的末端
1．限制酶產(chǎn)生匹配粘端（matched ends）
識(shí)別位點(diǎn)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后,產(chǎn)生的末端為匹配粘端,亦即粘性末端（cohesive end）,這樣形成的兩個(gè)末端是相同的,也是互補(bǔ)的.若在對(duì)稱軸 5' 側(cè)切割底物, DNA 雙鏈交錯(cuò)斷開產(chǎn)生 5' 突出粘性末端,如 EcoRⅠ ；若在 3'-側(cè)切割,則產(chǎn)生 3' 突出粘性末端,如 KpnⅠ .
NNG↓AATTCNN EcoRⅠ NNG AATTCNN
NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN
2．限制酶產(chǎn)生平末端（Blunt end）
在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割 DNA 的兩條鏈,則產(chǎn)生平末端,如 HaeⅢ（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）.產(chǎn)生平末端的 DNA 可任意連接,但連接效率較粘性末端低.
3．限制酶產(chǎn)生非對(duì)稱突出端
許多限制酶切割 DNA 產(chǎn)生非對(duì)稱突出端.當(dāng)識(shí)別序列為非對(duì)稱序列時(shí),切割的 DNA 產(chǎn)物的末端是不同的,如 BbvCⅠ ,它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下.
CC↓TCAGC
GGAGT↑CG
有些限制酶識(shí)別簡(jiǎn)并序列,其識(shí)別的序列中有幾種是非對(duì)稱的.如 AccⅠ ,它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下,其中 GTAGAC 和 GTCTAC 為非對(duì)稱.
GT↓AT/CGAC
CATA/GC↑TG
有些限制酶識(shí)別間隔序列,間隔區(qū)域的序列是任意的,如 DraⅢ 和 EarⅠ