是現(xiàn)在應(yīng)用最多的核酸測(cè)序技術(shù),由Sanger等1977年提出.
其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí),如果在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基,只要雙脫氧堿基摻入鏈端,該鏈就停止延長(zhǎng),鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長(zhǎng).如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5’端,以雙脫氧堿基為3’端的一系列長(zhǎng)度不等的核酸片段.反應(yīng)終止后,分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳.以分離長(zhǎng)短不一的核酸片段(長(zhǎng)度相鄰者僅差一個(gè)堿基),根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基,便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序.
(一) Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法)測(cè)序程序 操作程序是按DNA復(fù)制和RNA反轉(zhuǎn)錄的原理設(shè)計(jì)的.
1.分離待測(cè)核酸模板,模板可以是DNA,也可以是RNA,可以是雙鏈,也可以是單鏈.
2.在4只試管中加入適當(dāng)?shù)囊?、模板?種dNTP(包括放射性標(biāo)記dATP,例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA為模板,則用反轉(zhuǎn)錄酶）,再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddNTP(雙脫氧核苷酸).
3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板,要作變性處理)結(jié)合的引物,在DNA聚合酶作用下從5’端向3’端進(jìn)行延伸反應(yīng),32P隨著引物延長(zhǎng)摻入到新合成鏈中.當(dāng)ddNTP摻入時(shí),由于它在3’位置沒(méi)有羥基,故不與下一個(gè)dNTP結(jié)合,從而使鏈延伸終止.ddNTP在不同位置摻入,因而產(chǎn)生一系列不同長(zhǎng)度的新的DNA鏈.
4.用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時(shí)分離4只反應(yīng)管中的反應(yīng)產(chǎn)物,由于每一反應(yīng)管中只加一種ddNTP(如ddATP),則該管中各種長(zhǎng)度的DNA都終止于該種堿基(如A)處.所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA 3’ 末端都為同一種雙脫氧堿基.
5.放射自顯影.根據(jù)四泳道的編號(hào)和每個(gè)泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補(bǔ)的新鏈序列.
(二) 雙脫氧測(cè)序的示劑及具體操作步驟（以雙鏈DNA測(cè)序?yàn)槔?
1.變性雙鏈模板的制備
(1) 材料 Tris/葡萄糖緩沖液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,10mmo1/L EDTA,50mmo1/L 葡萄糖),1％ SDS,0.2mo1/L NaOH,異丙醇,TE緩沖液pH8.0,4mol/L LiCl,冰冷 70％和無(wú)水乙醇,2mol/L NaOH,2mmol/L EDTA.
(2) 配制方法
① 取1.5ml處于對(duì)數(shù)生產(chǎn)期的培養(yǎng)菌液(含有待測(cè)病毒核酸的重組質(zhì)粒模板),離心除去上清液后,用150?l Tris/葡萄糖緩沖液 重懸菌團(tuán),在室溫下放置5分鐘.
② 加入300?l的1％SDS,0.2mol/L NaOH,顛倒混合約15次,在室溫下放置15分鐘,加入225ml 3mol/L醋酸鈉(pH4.5),顛倒約15次混合,在冰浴中放置45分鐘,然后離心5分鐘.
③ 將650?l上清液轉(zhuǎn)移至一支新管中,加入650?l異丙醇,混合后在室溫下放置10分鐘,離心5分鐘后棄去異丙醇,抽真空干燥沉淀.
④ 用125?l TE(pH 8.0)重新溶解DNA,加入375?l的4mol/L LiCl,在冰浴中放置20分鐘后,于4℃下離心5分鐘.
⑤ 將上清液轉(zhuǎn)移至一支新管中用飽和苯酚抽提后再用氯仿抽提,加入2倍體積的異丙醇,在室溫下沉淀30分鐘,離心5分鐘,棄去上清液.
⑥ 用冰冷的70％乙醇洗沉淀,離心5分鐘,棄去上清液并干燥,用50?l TE緩沖液重新溶解沉淀.用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA含量.
⑦ 取0.2?g質(zhì)粒DNA,并將體積調(diào)至9?l,加入1?l 2mol/L NaOH,2mmol/L EDTA,在室溫下放置5分鐘,加入2?l 30mol/L醋酸鈉(pH 4.5)和8?l水.
⑧ 加入6?l冰冷無(wú)水乙醇,混合后在干冰／乙醇浴中放置15分鐘,在4℃下離心5分鐘,小心地棄去上清液,用冰冷的70％乙醇洗沉淀,離心5分鐘并小心地棄去上清液,真空抽干沉淀,并用TE緩沖液重新溶解沉淀.
2.延伸和終止反應(yīng) 以利用T7DNA聚合酶進(jìn)行的雙脫氧鏈終止反應(yīng)為例.
(1) 材料 變性的雙鏈DNA模板(溶解在TE緩沖液中),0.5pmol/?L寡核苷酸引物(溶解在TE中,-20℃貯存),5×測(cè)序緩沖液(200mmol/L Tris pH7.5,50mmol/L MgCl2,-20℃貯存),0.1mol/l DTT(當(dāng)月新配-20℃貯存),15pmol/L的3種dNTP混合物(缺dATP),1 000至1 500Ci/mmol ?32p dATP(在－20℃下達(dá)4至6周),修飾的T7 DNA聚合酶,標(biāo)準(zhǔn)酶稀釋溶液(20mmol/L Tris－HCl pH7.5,0.5mg/mlBSA,10mmol/L ?- 巰基乙醇,4℃貯存),終止混合物(表2-30),甲酰胺上樣緩沖液(0.2ml 0.5mol/LEDTA pH8.0,10mg溴酚藍(lán),10mg二甲苯青,10ml甲酰胺).
表2-30 T7DNA聚合酶終止反應(yīng)混合物
反應(yīng)成分 ddG ddA ddT ddC 最終濃度
H2O 15 15 15 15 －
5×測(cè)序緩沖液 6 6 6 6 － 1mmol/L
4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L
1mmol/L ddGTP 3 － － － 20μmol/L
1mmol/L ddATP － 3 － － 20μmol/L
1mmol/L ddTTP － － 3 － 20μmol/L
1mmol/L ddCTP － － － 3 20μmol/L
(2) 配制方法
① 取4支0.5?l小離心管,標(biāo)上G、A、T、C,每管加入7?l變性的雙鏈DNA模板(分別為1和2?g),1?l寡核苷酸引物和2?l 5×測(cè)序緩沖液混合,65℃保溫2分鐘,在室溫下冷卻30分鐘.
② 每管加入1?l 0.1mol/L DTT,2?l 1.5mol/L 3種dNTP混合物,0.5?l ?32P dATP和2?l(2IU)修飾的T7DNA多聚酶混合物,在室溫下放置5分鐘.
③ 按標(biāo)記每管分別加入3?l 4種ddNTP終止混合物的一種.
④ 短促離心后,在37℃下保溫5分鐘.
⑤ 加入5ml甲酰胺上樣緩沖液,上樣前在80℃下加熱2分鐘,并迅速置于冰浴上,每個(gè)樣品取3?l,上樣電泳.
3.測(cè)序反應(yīng)物電泳和序列讀取
(1) 按普通聚丙烯酰胺凝膠制作方法制作梯度膠.
(2) 按G、A、T、C次序加入每種樣品,在G、A和T各泳道上樣1ml,而在C泳道上樣1.5?l.
(3) 上樣完畢加壓1700V電泳,根據(jù)樣品中溴酚藍(lán)和二甲苯青染料遷移情況確定電泳時(shí)間.
(4) 電泳完畢,在10℃冰醋酸中漂洗30分鐘脫去尿素.
(5) 在60℃或80℃干燥30分鐘后,放射自顯影讀取序列.
人類基因組測(cè)序也是用的這個(gè)~~