什么是Westernblot?
最佳答案
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測.對已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,對新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過融合部分的抗體檢測.
一、原理
與Southern或Northern雜交方法類似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質(zhì),“探針”是抗體,“顯色”用標(biāo)記的二抗.經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變.以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分.該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá).
二、試劑準(zhǔn)備
1、SDS-PAGE試劑:見電泳實(shí)驗(yàn).
2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml.
3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml.
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml.
5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml.包被液（5%脫脂奶粉,現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中.
6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0μl.
三、操作步驟
（一）蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后,可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞,真核細(xì)胞加勻漿緩沖液,機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min.然后4℃,13,000g離心15min.取上清液作為樣品.
（二）電泳：制備電泳凝膠,進(jìn)行SDS-PAGE.
（三）轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）
1、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小,用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡,5min×3次.
2、膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜,浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min.
3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好,濾紙、凝膠、NC膜精確對齊,每一步去除氣泡,上壓500g重物,將碳板上多余的液體吸干.接通電源,恒流1mA/cm2,轉(zhuǎn)移1.5hr.轉(zhuǎn)移結(jié)束后,斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡.將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脫色,至背景清晰,然后用雙蒸水洗,風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存,留與顯色結(jié)果作對比.
（四）免疫反應(yīng)：
1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次.
2、加入包被液,平穩(wěn)搖動,室溫2hr.
3、棄包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次.
4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋,液體必須覆蓋膜的全部）,4℃ 放置12hr以上.陰性對照,以1%BSA取代一抗,其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同.
5、棄一抗和1%BSA,用0.01M PBS分別洗膜,5min×4次.
6、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01MPBS稀釋）,平穩(wěn)搖動,室溫2hr.
7、棄二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次.
8、加入顯色液,避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng).
四、注意事項(xiàng)
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件.
2、顯色液必須新鮮配置使用,最后加入H2O2.
3、DAB有致癌的潛在可能,操作時要小心仔細(xì)