首先需要構(gòu)建dsRNA表達(dá)載體
將這種載體導(dǎo)入受體細(xì)胞中后
表達(dá)產(chǎn)生的dsRNA在DICER酶作用下形成siRNA
引起具有相同序列的mRNA發(fā)生講解
導(dǎo)致細(xì)胞或個(gè)體不能合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)
所以個(gè)體會(huì)表現(xiàn)出功能缺失表型
構(gòu)建表達(dá)載體通常選用dsRNA
需要注意的一些方面是
dsRNA序列中GC的含量要小于50%
高GC含量會(huì)降低RNAi的效果
選定的dsRNA序列應(yīng)通過搜索數(shù)據(jù)庫(kù)確保與其他基因無同源性
以避免對(duì)其他同源性基因表達(dá)的抑制
不同區(qū)域的dsRNA具有不同的基因沉默效果
可同時(shí)構(gòu)建兩個(gè)以上針對(duì)同一基因不同靶區(qū)域的dsRNA表達(dá)載體
還要充分考慮siRNA的結(jié)構(gòu)特征
siRNA與mRNA的同源程度對(duì)RNAi有明顯影響
啟動(dòng)子區(qū)或者編碼區(qū)與siRNA同源的基因受siRNA抑制
但siRNA在動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)mRNA的前體沒有影響
所以含非編碼區(qū)序列的dsRNA不會(huì)引起RNAi
而且在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)
經(jīng)常使用U6啟動(dòng)子等RNA聚合酶Ⅲ能夠識(shí)別的啟動(dòng)子序列
最后將其轉(zhuǎn)入到質(zhì)粒中
這里說的只是一個(gè)簡(jiǎn)單的過程
總的來說構(gòu)建表達(dá)載體是個(gè)比較復(fù)雜的過程
如果要知道詳細(xì)的技術(shù)
建議還是去看書吧
這里是說不清的
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正反義表達(dá)載體就是把目的基因正向或者反向插入到質(zhì)粒中再轉(zhuǎn)染
質(zhì)粒中含有正向插入目的基因的就是正義表達(dá)載體
含有反向插入的就是反義表達(dá)載體