一種全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技術(shù)
DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾,它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl-transferase,Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體,將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應(yīng),在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學(xué)性修飾堿基.CG二核苷酸是最主要的甲基化位點(diǎn),它在基因組中呈不均勻分布,存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域,在哺乳動(dòng)物中mC約占C總量的2－7％.一般說(shuō)來(lái),DNA的甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá).DNA的甲基化對(duì)維持染色體的結(jié)構(gòu)、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發(fā)生發(fā)展都起重要的作用.
CpG雙核苷酸在人類(lèi)基因組中的分布很不均一,而在基因組的某些區(qū)段,CpG保持或高于正常概率,這些區(qū)段被稱(chēng)作CpG島.CpG島主要位于基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域,約有60％以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島.CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常主要的地位.通過(guò)基因啟動(dòng)子區(qū)及附近區(qū)域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá),從而引起相應(yīng)基因沉默,去甲基化又可恢復(fù)其表達(dá).DNA甲基化在生理情況下就參與了控制基因的時(shí)空表達(dá),在腫瘤發(fā)生時(shí),腫瘤細(xì)胞全基因組低甲基化是一個(gè)重要特征.腫瘤細(xì)胞基因組甲基化的程度與正常細(xì)胞相比僅為20-60% ,同時(shí)伴有局部區(qū)域基因的高甲基化,包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、DNA修復(fù)基因、血管形成抑制基因等.但是目前研究手段的局限,限制了DNA甲基化的廣泛研究.
近年來(lái),研究者不斷探索定性及定量檢測(cè)單個(gè)或多個(gè)甲基化位點(diǎn)的方法,但由于甲基化多態(tài)性區(qū)域存在的密度很高,所以對(duì)于延伸反應(yīng)其引物的位置很難設(shè)計(jì).Pyrosequencing技術(shù)作為一種新的序列分析技術(shù),能夠快速地檢測(cè)甲基化的頻率,對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定性及定量檢測(cè),為甲基化研究提供了新的途徑.
從原理上來(lái)看,Pyrosequencing是一種通過(guò)合成方法進(jìn)行序列分析的方法,它通過(guò)核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè).這項(xiàng)技術(shù)曾經(jīng)被用作單核苷酸多態(tài)性（SNP）的基因型和單倍型的檢測(cè),以及細(xì)菌和病毒的鑒定和分型研究.這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)主要特點(diǎn)是在Pyrogarm™軟件上顯示的峰值高度來(lái)自于序列分析的原始數(shù)據(jù),通過(guò)峰值的高度可以精確的檢測(cè)混合DNA模板中等位基因的頻率.
目前甲基化研究方面,很多甲基化定量分析的報(bào)道采用亞硫酸氫鹽處理甲基化樣本,并用混合的PCR產(chǎn)物
作為校正.其主要原理是：亞硫酸氫鹽可以將沒(méi)有甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下甲基化的胞嘧啶保持不變.因而,用它處理樣本后,再進(jìn)行PCR擴(kuò)增,甲基化的位點(diǎn)可以被當(dāng)作一個(gè)C/T的SNP來(lái)處理,它的基因頻率為0－100％.在此,我們給大家介紹一個(gè)研究人員使用Pyrosequencing技術(shù)分析并精確定量DNA甲基化水平的例子.
研究者在一個(gè)Pyrosequencing反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)了6個(gè)甲基化位點(diǎn).這種方法同樣可以用于石蠟包埋的組織,并且具有較高的重復(fù)性和精確性.實(shí)驗(yàn)選擇谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶π（GSTP1）轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)的CpG島進(jìn)行檢測(cè).這些位點(diǎn)在正常前列腺組織中是非甲基化的,而在腫瘤樣本中高甲基化.通過(guò)PCR擴(kuò)增一個(gè)包含17個(gè)甲基化多態(tài)位點(diǎn)140bp的片段,并用4個(gè)測(cè)序引物研究其中15個(gè)位點(diǎn)（Table 1）.使用在線的SNP測(cè)序引物設(shè)計(jì)軟件（Pyrosequencing AB）設(shè)計(jì)測(cè)序引物,其中一些甲基化多態(tài)性位點(diǎn)用最可能的堿基所代替,以減少計(jì)算的數(shù)量.再通過(guò)人工檢測(cè)測(cè)序引物可能存在的錯(cuò)配.此外,同時(shí)在PSQ 96MA DNA分析儀上運(yùn)行空白對(duì)照,扣除由測(cè)序引物、生物素標(biāo)記的引物或是模板引起的背景.
PCR引物設(shè)計(jì)完全與模板相匹配,不覆蓋任何甲基化多態(tài)性區(qū)域.使用10ng亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA樣本或是10 fmol純化的PCR產(chǎn)物,10 pmol 正向（5’-GTGATTTAGTATTGG-3’）和反向（5’-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3’）引物擴(kuò)增GSTP1轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)的基因片段,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為144bp.反應(yīng)體系為60 mM Tris-SO4,pH 8.9,18 mM (NH4)2SO4,1 mM MgSO4,200 μM dNTPs,以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶,終體積為50μL.PCR循環(huán)設(shè)置：首先在95℃下變性4分鐘,然后在95℃ 30S,50℃ 45S以及72℃ 20S條件下重復(fù)50個(gè)循環(huán),最后一步延伸步驟在72℃下4分鐘,中止反應(yīng).PCR反應(yīng)在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳動(dòng)物基因組中,DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化.DNA甲基化是一種基因外修飾,不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu); 他在細(xì)胞正常發(fā)育、基因表達(dá)模式以及基因組穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用.全基因組低甲基化,維持甲基化模式酶的調(diào)節(jié)失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類(lèi)腫瘤中普遍存在的現(xiàn)象.DNA高甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的又一個(gè)機(jī)制.