分光光度法是基于不同分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對(duì)電磁輻射的選擇性吸收而建立起來(lái)的方法,屬于分子吸收光譜分析.當(dāng)光通過(guò)溶液時(shí),被測(cè)物質(zhì)分子吸收某一波長(zhǎng)的單色光,被吸收的光強(qiáng)度與光通過(guò)的距離成正比.雖然現(xiàn)在了解到Bouguer早在1729年已提出上述關(guān)系的數(shù)學(xué)表達(dá)式,但通常認(rèn)為L(zhǎng)ambert于1760年最早發(fā)現(xiàn)表達(dá)式,其數(shù)學(xué)形式為:
T=I/I0=e-kb
其中I0為入射光強(qiáng),I為透射光強(qiáng),e為自然對(duì)數(shù)的底,k為常數(shù),b為光程長(zhǎng)度(通常以cm表示).
比爾定律等同于Bouguer定律,只是比爾定律以濃度來(lái)表達(dá).將兩個(gè)定律結(jié)合起來(lái),組成Beer-Bouguer定律:
T=I/I0=e-kbc
其中c為吸光物質(zhì)的濃度(通常以g/L或mg/L為單位).將上式取以10為底的對(duì)數(shù)后,得到線性表達(dá)式:
A=-logT=-log(I/I0)=log(I0/I)=εbc
其中A為吸光度,ε是摩爾吸收光系數(shù)或消光系數(shù).
上述表達(dá)式通常稱(chēng)為比爾定律.它表明,當(dāng)特定波長(zhǎng)的單色光通過(guò)溶液時(shí),樣品的吸光度與溶液中吸收物濃度和光通過(guò)的距離成正比.
在波長(zhǎng)、溶液和溫度確定的情況下,摩爾消光系數(shù)是由給定物質(zhì)的特性決定的.實(shí)際上,測(cè)得的摩爾消光系數(shù)也和使用的儀器有關(guān).因此,在定量分析中,通常并不用已知物質(zhì)的摩爾消光系數(shù),而是用一個(gè)或多個(gè)已知濃度的待測(cè)物質(zhì)作一條校準(zhǔn)或工作曲線.
：①吸光系數(shù)：Beer定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為A=kbc,若溶液的濃度c以g/L為單位,b為光徑以cm為單位,則常數(shù)K稱(chēng)為吸光系數(shù),以a表示,其單位為升/（克·厘米）[L/(g·cm],A=kbc可寫(xiě)成A=abc.②摩爾吸光系數(shù)：公式A=kbc中的以為1mol/L,b為1cm時(shí),則系數(shù) k稱(chēng)為摩爾吸光系數(shù),以ε表示,單位為升/（摩爾·厘米）[L/(mol·cm）],A=kbc可寫(xiě)成A=εc.在實(shí)際工作中,不能直接用1mol/L這種高濃度的溶液測(cè)定吸光度,而是在稀釋成適當(dāng)濃度時(shí)測(cè)定吸光度進(jìn)行運(yùn)算.ε值與入射光波長(zhǎng)、溶液的性質(zhì)等因素有關(guān).如NADH在260nm時(shí)ε為 15000,寫(xiě)成ε260NADH=15×103；在340nm時(shí)ε為6220,寫(xiě)成ε340NADH=6.22×103.③比吸光系數(shù)：如公式A= kbc中的c是百分濃度（w/v）b為cm,則常數(shù)k可用E%表示,稱(chēng)為比吸光系數(shù)或百分吸光系數(shù),A=kbc可寫(xiě)成A=E%bc.當(dāng)待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)是已知者可用ε值分析,若所測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)是未知的,則ε無(wú)法確定,此時(shí)用比吸光系數(shù)分析就很方便.a、ε和E常用作粗定量分析,主要用于定性分析.