關(guān)鍵需要看你偶聯(lián)的蛋白的特性.需要根據(jù)蛋白特性來(lái)選擇不同的偶聯(lián)方法,不同的偶聯(lián)方法針對(duì)的功能基團(tuán)不同,位置當(dāng)然更加不固定了,活化劑種類(lèi)更多,不是沒(méi)有人回答你的問(wèn)題,而是你的問(wèn)題范圍太廣無(wú)法回答!
我曾經(jīng)做過(guò)小分子和蛋白質(zhì)的偶聯(lián),有一些自己總結(jié)的綜述,
人工抗原合成常用的載體
載體表面應(yīng)首先應(yīng)具有化學(xué)活性基團(tuán),這些基團(tuán)可以直接與抗生素或農(nóng)藥分子偶聯(lián),這是化學(xué)偶聯(lián)制備抗原的前提；其次,載體應(yīng)具備一定的容量,可以偶聯(lián)足夠的分子；載體還應(yīng)該是惰性的,不應(yīng)干擾偶聯(lián)分子的功能；而且載體應(yīng)具有足夠的穩(wěn)定性,且應(yīng)該是廉價(jià)易得的.
常用來(lái)作為合**工抗原的載體蛋白質(zhì)有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚賴(lài)氨酸(PLL)等.這些蛋白質(zhì)分子中的α和ε-氨基（等電點(diǎn)8和10）、苯酚基、巰基（等電點(diǎn)為9）、咪唑基（等電點(diǎn)為7）、羧基（等電點(diǎn)2～4,大部分來(lái)自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等電點(diǎn)pH條件下,一部分成為質(zhì)子,另一部分未質(zhì)子化的親核基團(tuán)則具有反應(yīng)活性,可與半抗原中的對(duì)應(yīng)基團(tuán)結(jié)合.當(dāng)然,這些基團(tuán)的反應(yīng)性也取決于蛋白質(zhì)各種氨基酸殘基的微環(huán)境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的賴(lài)氨酸,故有許多自由氨基存在,且在不同pH和離子強(qiáng)度下能保持較大的溶解度.此外,這些蛋白質(zhì)在用有機(jī)溶劑（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解時(shí),其活性基團(tuán)仍呈可溶狀態(tài),因此,這兩種蛋白質(zhì)是最常用的載體蛋白質(zhì)[30].近年來(lái),有研究報(bào)道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚賴(lài)氨酸)作載體,表現(xiàn)出能增加半抗原的免疫原性,從而使產(chǎn)生征對(duì)半抗原的特異性抗體可能性增加,被廣泛應(yīng)用[31,32].
1.2.2人工抗原合成方法
小分子半抗原與載體蛋白偶聯(lián)效果會(huì)受到偶聯(lián)物的濃度及其相對(duì)比例、偶聯(lián)劑的有效濃度及其相對(duì)量、緩沖液成分及其純度和離子強(qiáng)度、pH以及半抗原的穩(wěn)定性、可溶性和理化特性等因素的影響.通常是在條件溫和的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價(jià)結(jié)合,不宜在高溫、低溫、強(qiáng)堿、強(qiáng)酸條件下進(jìn)行.一般是由半抗原上的活性基團(tuán)決定偶聯(lián)合成的方法,常用的方法如下：
1.2.2.1分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶聯(lián)
1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也稱(chēng)氯甲酸異丁酯法.半抗原上的羧基在正丁胺存在下與氯甲酸異丁酯反應(yīng),形成混合酸酐的中間體,再與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng),形成半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合物
2）碳二亞胺法（CDI）：碳二亞胺(EDC)使羥基和氨基間脫水形成酰胺鍵,半抗原上的羧基先與EDC反應(yīng)生成一個(gè)中間物,然后再與蛋白質(zhì)上的氨基反應(yīng),形成半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合物（見(jiàn)圖1.5）.EDC被稱(chēng)作零長(zhǎng)度交聯(lián)劑之一,因?yàn)樗鳛轷０锋I的形成介質(zhì)并沒(méi)有形成手臂分子.
此連接方法十分簡(jiǎn)便,只需將載體蛋白質(zhì)和抗原按一定比例混合在適當(dāng)?shù)娜芤褐?然后加入水溶性碳化二亞胺,攪拌1～2h,置室溫24h,再經(jīng)透析即可.如果半抗原分子中不含羧基,可通過(guò)某些化學(xué)反應(yīng)引入羧基.在引入羧基后,也可用上述方法進(jìn)行偶聯(lián).
1.2.2.2含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián)
1）戊二醛法：雙功能試劑戊二醛的兩個(gè)醛基分別與半抗原和蛋白質(zhì)上的氨基形成schiff鍵(-N=C