一、大腸菌群介紹
大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名,而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語,它不代表某一個或某一屬細(xì)菌,而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌,這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致,其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌.一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等.
大腸菌群分布較廣,在溫血動物糞便和自然界廣泛存在.調(diào)查研究表明,大腸菌群細(xì)菌多存在于溫血動物糞便、人類經(jīng)常活動的場所以及有糞便污染的地方,人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因.糞便中多以典型大腸桿菌為主,而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多.
大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的,主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染.大腸菌群數(shù)的高低,表明了糞便污染的程度,也反映了對人體健康危害性的大小.糞便是人類腸道排泄物,其中有健康人糞便,也有腸道患者或帶菌者的糞便,所以糞便內(nèi)除一般正常細(xì)菌外,同時也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等）,因而食品中有糞便污染,則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性,潛伏著食物中毒和流行病的威脅,必須看作對人體健康具有潛在的危險性.
大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一,目前已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中.
二、大腸菌群檢驗(yàn)方法：
由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌,即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌.因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進(jìn)行.
目前國內(nèi)采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標(biāo)準(zhǔn)和原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).兩個標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測程序上略有不同.
（一）國家標(biāo)準(zhǔn)：國家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法,即：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn).
乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：樣品稀釋后,選擇三個稀釋度,每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管.36±1℃培養(yǎng)48±2h,觀察是否產(chǎn)氣.
分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,36±1℃培養(yǎng)18-24h,觀察菌落形態(tài).
證實(shí)試驗(yàn)：挑取平板上的可疑菌落,進(jìn)行革蘭氏染色觀察.同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h,觀察產(chǎn)氣情況.
報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽性的管數(shù),查MPN表,報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的MPN值.
具體操作參見GB4789.3-94 《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測定》
（二）原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),等效采用美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法,用于對出口食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測.本方法采用兩步法：
推測試驗(yàn)：樣品稀釋后,選擇三個稀釋度,每個稀釋度接種三管LST肉湯.36±1℃培養(yǎng)48±2h,觀察是否產(chǎn)氣.
證實(shí)試驗(yàn)：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中,36±1℃培養(yǎng)48±2h,觀察是否產(chǎn)氣.以BGLB產(chǎn)氣為陽性.查MPN表,報(bào)告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值.
具體操作參見 SN0169-92 《中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法》
三、說明：
1．MPN檢索表：
MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱.這種方法,對樣品進(jìn)行連續(xù)系列進(jìn)行稀釋,加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率,用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值.
MPN檢索表只給了三個稀釋度,如改用不同的稀釋度,則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍.注意國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中所附MPN表所用稀釋度是不同的,而且結(jié)果報(bào)告單位也不相同.
2．初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：
無論是國家標(biāo)準(zhǔn)的三步法還是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的兩步法,都利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行了兩次發(fā)酵試驗(yàn),培養(yǎng)基的配制略有不同,但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義,即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”.
初發(fā)酵陽性管,不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌,經(jīng)過證實(shí)試驗(yàn)后,有時可能成為陰性.有數(shù)據(jù)表明,食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率,初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大.因此,在實(shí)際檢測工作中,證實(shí)試驗(yàn)是必需的.
3．產(chǎn)氣量與倒管：
在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中,經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時比小米粒還?。?有時可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡.實(shí)驗(yàn)表明,大腸菌群的產(chǎn)氣量,多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體,少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡.如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時,可以用手輕輕打動試管,如有氣泡沿管壁上浮,即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生,而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn).
4．挑選菌落：
國家標(biāo)準(zhǔn)中,需要對初發(fā)酵陽性培養(yǎng)物接種伊紅美藍(lán)平板分離,對典型和可疑菌落進(jìn)行觀察和證實(shí)試驗(yàn).由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱,在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣,而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān).國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基,在該平板上,大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時,檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低.
另外,挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系,只挑取一個菌落,由于機(jī)率問題,尤其當(dāng)菌落不典型時,很難避免假陰性的出現(xiàn).所以挑菌落一定要挑取典型菌落,如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個,以免出現(xiàn)假陰性.
5．抑菌劑：
大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等.抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌,特別是革蘭氏陽性菌的生長.
國家標(biāo)準(zhǔn)中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑,行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑,BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑.
抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌,而有利于大腸菌群細(xì)菌的生長和挑選,但對大腸菌群中的某些菌株有時也產(chǎn)生一些抑制作用.有些抑菌劑用量甚微,稱量時稍有誤差,即可對抑菌作用產(chǎn)生影響,因此抑菌劑的添加應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行.