用于基因工程的工具酶
一,限制性內(nèi)切酶(Endonucleosase)
(一)限制性內(nèi)切酶(Endonucleosase)的發(fā)現(xiàn)與分類
1) 50年代初發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將外來(lái)DNA片段在某些專一位點(diǎn)上切斷,從而保證其不為外來(lái)噬菌體所感染,而其自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護(hù),這種現(xiàn)象叫做限制-修飾,它們由三個(gè)基因位點(diǎn)所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年后,人們搞清了細(xì)菌的限制與修飾分子機(jī)理:
hsd R---限制性內(nèi)切酶
hsd M---限制性甲基化酶
hsd S---控制兩個(gè)系統(tǒng)的表達(dá)
1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株中分離出兩個(gè)類內(nèi)切酶,Hind II和Hind III,為基因工程技術(shù)的誕生奠定了基礎(chǔ).
截止到目前為止,已經(jīng)分離出400余種II類酶,搞清識(shí)別位點(diǎn)的有300種,商品化的約有一百種,而實(shí)驗(yàn)室常用的有二十種 .
2)限制性核酸內(nèi)切酶可分為三大類:
I類 能識(shí)別專一的核苷酸順序,并在識(shí)別點(diǎn)附近切割雙鏈,但切割序列沒(méi)有專一性.
II類 識(shí)別位點(diǎn)(回文序列)嚴(yán)格專一,并在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)將雙鏈切斷
III類 識(shí)別位點(diǎn)嚴(yán)格專一(不是回文序列),但切點(diǎn)不專一,往往不在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部.
因此在基因工程中具有實(shí)用價(jià)值的是II類限制性內(nèi)切酶.
(二)II類限制性內(nèi)切酶的命名及特性
命名原則:取屬名的第一個(gè)字母大寫(xiě),取種名的前兩個(gè)字母小寫(xiě),構(gòu)成基本名稱.該種中發(fā)現(xiàn)的不同的酶按照順序編號(hào)I, II, III等.如存在變種和品系,取變種或品系的一個(gè)字母.若酶存在于質(zhì)粒上,則需大寫(xiě)字母表示非染色體遺傳因子.
如,HindIII從Haemophilus Influenzue d株中分離的第三個(gè)酶.EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗藥性R質(zhì)粒上.
(三)II類限制性內(nèi)切酶的底物識(shí)別順序及切割位點(diǎn)
絕大多數(shù)的II類限制性內(nèi)切酶在底物DNA上的識(shí)別順序長(zhǎng)度為4,5,6堿基對(duì),這些堿基對(duì)的順序呈回文結(jié)構(gòu)(Palindromic),而且切點(diǎn)就在其內(nèi)部,如EcoRI 5'-GAATTC-3' .
DNA被限制性內(nèi)切酶切開(kāi)之后,呈現(xiàn)兩種斷口:
鈍端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等
粘端(粘性末端)如:EcoR I等
圖2-1 限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端
(四)識(shí)別位點(diǎn)在DNA分子中的頻率
對(duì)于特定的限制性酶在DNA分子中的識(shí)別位點(diǎn)數(shù)目是可以計(jì)算的,四堿基的酶平均大約每256個(gè)核苷酸(44)有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn),而六堿基的酶大約4096(46)個(gè)核苷酸有一個(gè)識(shí)別序列,計(jì)算是在假定核苷酸隨機(jī)排列的情況下進(jìn)行的.實(shí)踐中這種方法不完全正確,如λ DNA長(zhǎng)49kb,對(duì)于六堿基的酶應(yīng)該有12個(gè)切割位點(diǎn),實(shí)際上要少一些,如Bgl II只有6個(gè),BamHI只有5個(gè),而SalI只有2個(gè).
二,甲基化酶
在專一位點(diǎn)上甲基化,與限制性內(nèi)切酶相對(duì)應(yīng).
(一)大腸桿菌中的甲基化酶
dam甲基化酶: 可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,這樣可使一些識(shí)別順序中含有5'GATC3'的限制性內(nèi)切酶不能切割來(lái)自大腸桿菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)則不會(huì)因?yàn)镹6A的甲基化而失去活性,因?yàn)檫@兩種酶對(duì)底物的特異性不同.
dcm甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影響的限制性內(nèi)切酶是EcoR II.
(二) 甲基化酶在基因工程中用途
許多II類限制性內(nèi)切酶,都存在著相對(duì)的甲基化酶,它們可修飾限制酶識(shí)別順序中的第三位腺嘌呤上,封閉酶切位點(diǎn),從而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到EcoRI識(shí)別順序中的第三位腺嘌呤上,從而使DNA免受EcoRI的切割.
三,T4-DNA連接酶(T4-DNA Ligase)
來(lái)源于T4噬菌體感染的大腸桿菌,連接修復(fù)3'端羥基和5'端磷酸基因,脫水形成3'-5'磷酸二酯鍵
連接雙鏈DNA上的單鏈缺口(Nick),因此亦可連接限制內(nèi)切酶所產(chǎn)生的粘性末端
連接RNA模板上的DNA鏈缺口
連接平頭雙鏈DNA速度很慢,在高濃度的底物和酶的作用下方可進(jìn)行,這屬于分子之間的連接.
圖2-2 連接酶的作用方式
四,核酸酶
作用: 降解磷酸二酯鍵
分為:外切酶 內(nèi)切酶
(一) Bal 31(來(lái)自于細(xì)菌Alteromonas espejiana) 單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性,雙鏈特異的內(nèi)切酶活性.依賴于Ca2+
用途:
構(gòu)建限制酶圖譜
產(chǎn)生末端缺失突變
DNA超螺旋線性化
(二)E. coli外切酶III
只降解DNA分子的一條鏈,產(chǎn)生單鏈的DNA分子.
(三)S1核酸酶(來(lái)源于米曲霉菌)
特性:
1. 降解單鏈DNA或RNA,降解DNA的速度大于降解的速度
2. 降解發(fā)生的方式為內(nèi)切和外切
3. 酶切活性需4.0-4.5pH環(huán)境,Zn2+激活
4. 酶量過(guò)大時(shí)會(huì)降解雙鏈核酸,因?yàn)殡p鏈降解活性比單鏈低75000倍
(四) DNase I: 來(lái)自于牛胰腺, 既可以降解單鏈也可以降解雙鏈,沒(méi)有特異性,產(chǎn)生單核苷酸或短鏈
五,聚合酶
(一)DNA聚合酶I
5'-3'聚合酶活性
3'-5'外切酶活性
5'-3'外切酶活性
核酸內(nèi)切酶活性
可以被枯草桿菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5'-3'外切酶活性的分子.
圖2-3 DNA聚合酶I
(二) Klenow酶
該酶無(wú)5'-3'外切活性,保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性,基因工程中利用該酶:
修復(fù)限制性內(nèi)切酶造成的5'突出的粘性末端
標(biāo)記DNA探針
催化cDNA第二條鏈的合成
末端終止法測(cè)序
圖2-4 Klenow 酶的作用方式
(三) T4 DNA聚合酶
與Klenow酶相似,外切酶活性更高.體外誘變反應(yīng)中效率很高.
(四)T7 DNA聚合酶
測(cè)序酶
(五) Taq DNA聚合酶
耐高溫,主要用于PCR反應(yīng).
(六) 逆轉(zhuǎn)錄酶:將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(鳥(niǎo)類成髓細(xì)胞性白血病病毒)
DNA聚合酶活性
RNase H活性
DNA內(nèi)切酶活性
核酸結(jié)合活性
M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Moloney鼠白血病病毒)
兩種逆轉(zhuǎn)錄酶的區(qū)別
肽鏈的組成
禽酶2條肽鏈,具聚合酶和很強(qiáng)的RNase H活性
鼠酶1條,較弱的RNase H活性
反應(yīng)的最適溫度
禽酶42°C,二級(jí)結(jié)構(gòu)豐富RNA,禽酶效率高
反應(yīng)的最適pH值
禽酶pH 8.3
鼠酶pH 7.6
六,DNA修飾酶
有大量的修飾酶,主要的有以下幾種:
1) 堿性磷酸酯酶(來(lái)自于大腸桿菌或小牛腸道)可以去掉DNA分子的5'端的磷酸基團(tuán).
2) polynucleotide kinase: 來(lái)自于T4侵染的大腸桿菌,在5'端增加磷酸基團(tuán).
3) 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl tansferase) 來(lái)自于小牛胸腺組織,在DNA分子的3'端增加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸.
4) Topoisomerase改變共價(jià)閉合雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)
第二節(jié) DNA的切割反應(yīng)
一,緩沖系統(tǒng)的組成
II類酶的酶活條件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM
根據(jù)不同酶對(duì)鹽離子要求不同,可將緩沖液分為以下三種情況:
高鹽:100-150mM
中鹽:50-100mM
低鹽:0-50mM
二,酶切操作
DNA量的確定,加入酶量的確定,發(fā)應(yīng)體積的確定(20μl),反應(yīng)時(shí)間的確定,1-1.5hr,一般為37℃,但也有例外,如Taq I在65°C時(shí)活性最高.
單位限制性內(nèi)切酶定義為:在最佳緩沖系統(tǒng)和20μl體積中反應(yīng)1小時(shí),完全水解1μgDNA所需的酶量.
三,酶切結(jié)果分析
(一) 酶切片段的檢測(cè)
1) 通過(guò)凝膠電泳分離,根據(jù)分子量分離.根據(jù)凝膠的濃度可以分離不同分子量的片段,聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分離1-300bp的分子.
2) DNA分子的檢測(cè) a. 染色EB,DNA分子小于25ng,很難檢測(cè)到
b. 放射性自顯影, 可以監(jiān)測(cè)少到2ng DNA分子.
(二)估計(jì)DNA分子的大小
根據(jù)DNA分子的遷移率,可以用公式計(jì)算出分子量D=a-b(logM)
D是移動(dòng)的距離,M是分子量,a, b是恒量但隨著電泳條件的改變而改變.
也可以根據(jù)已知大小的片段進(jìn)行比較,誤差約在5%左右.
四,多酶聯(lián)合酶解
對(duì)于對(duì)濃度要求相同的酶,原則上可以同時(shí)酶解;
對(duì)于對(duì)濃度要求不同的酶,可以:
1. 低鹽濃度的酶先切,后補(bǔ)加NaCL
2. 一種酶切后,換緩沖液,加5mM NaAc 0.1體積,2體積乙醇,冰浴5min,4℃離心10min,干燥
五,定位酶切位點(diǎn)
建立酶切圖譜需要一系列的酶.
首先確定每一種酶切后產(chǎn)生的分子量和片段的數(shù)目;
然后進(jìn)行雙酶切;
比較酶切和雙酶切的結(jié)果,繪制酶切圖譜;
含糊的位點(diǎn)可以通過(guò)部分酶切解決,可以短時(shí)間的酶切或者在4°C條件下進(jìn)行.
六, 限制性內(nèi)切酶的star活性
在PH不合適,或甘油濃度過(guò)高≥10%時(shí),限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)非專一性,因此應(yīng)確保酶的體積為總體積的十分之一以下.
第三節(jié) DNA片段的連接
重組DNA分子構(gòu)建的最后一步是連接,通過(guò)連接酶完成.相對(duì)而言,鈍端的連接效率較低,因此一般提高DNA濃度的方法增加接觸的機(jī)會(huì).而粘性末端的連接效率較高,因?yàn)閮蓚€(gè)粘性末端可以通過(guò)氫鍵堿基互補(bǔ)配對(duì).這種暫時(shí)的,堿基配對(duì)結(jié)構(gòu)可以提高連接的效率.在分子克隆的連接方式主要有以下幾種:
一,連接方式
(一)相同粘性末端的連接
來(lái)源:
相同的酶
同尾酶
問(wèn)題:
極性有兩種可能
同尾酶連接后,不能用任何一種酶酶切.稱為"焊死".
(二)平頭末端的連接
粘性末端--分子內(nèi)部連接,平頭末端--分子間的連接.
提高連接效率的方法:
加大酶用量(10倍)
加大平頭末端底物的濃度
加入10%PEG(8000),促進(jìn)分子間的有效作用
加入單價(jià)陽(yáng)離子, 150-200mM NaCl
提高反應(yīng)溫度
平頭連接同樣存在兩種極性
(三)不同粘性末端的連接
突出5'末端
Klenow補(bǔ)平,或S1核酸酶切平,然后平頭連接
突出3'末端
T4-DNApol切平,然后平頭連接
突出末端不同
Klenow補(bǔ)平,或S1核酸酶切平
連接后,可能恢復(fù)限制性位點(diǎn),甚至還可能產(chǎn)生新的位點(diǎn).XbaI與HindIII( XbaI恢復(fù)), XbaI與EcoRI(均保留),BamHI與Bgl II(產(chǎn)生ClaI位點(diǎn))
(四)人工粘性末端的連接
5'突出的末端
外源片段先用Klenow補(bǔ)平;然后用TdT補(bǔ)加polyC;載體片段也用Klenow補(bǔ)平,加polyG,退火不經(jīng)連接即可轉(zhuǎn)化.目的是:不使酶切位點(diǎn)遭受破壞.
3'突出的末端
外源片段先用TdT加polyG;載體片段加polyC;然后退火;再用Klenow補(bǔ)齊;連接
平頭末端
可直接用TdT補(bǔ)加末端,但以加polyA/T為佳.這樣稍微加熱,AT區(qū)就會(huì)出現(xiàn)單鏈區(qū)域,然后用S1核酸酶水解即可回收片段
(五)粘端與平端的連接
linker : 人工合成的,含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的,短的雙鏈DNA片段.
– 連接的效率較高
– 酶切時(shí)可能破壞DNA分子的完整.
adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸.
圖 2-5 linker的連接方式
(六)粘性末端的更換
在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口
– BamHI酶切片段用Klenow補(bǔ)平,或用S1酶切平;連接一段linker或Adaptor,使之產(chǎn)生EcoRI粘性末端.這樣BamHI切口就換成了EcoRI切口 .
– 由AluI更換EcoRI:AluI切開(kāi),T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切開(kāi),Klenow補(bǔ)平,連接,原來(lái)含有AluI的片段變成含有EcoRI
二,重組率
重組率:連接反應(yīng)結(jié)束后,含有外源DNA片段的重組分子數(shù)與加入的載體分子數(shù)之比.較為理想的重組率為25-75%
提高重組率的方法:
連接反應(yīng)條件 外源片段:載體=2:1-10:1(分子數(shù)),增加碰撞機(jī)會(huì),減少自身環(huán)化.
載體除磷 (磷酸酯酶5'除磷).
TdT在3'端增加人工粘性末端,防止載體自我環(huán)化 .