PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段,使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列.因此,引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否.
要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū).同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu).如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu),就要避開(kāi)它.如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu),那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物.
現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物.一般引物長(zhǎng)度為15~30堿基,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100~600堿基對(duì).
讓我們先看看P1引物.一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%.而且四種堿基的分布最好隨機(jī).不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在.否則P1引物設(shè)計(jì)的就不合理.應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物.
同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性,一般一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ).
引物確定以后,可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾,例如可以在引物的5′端加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等,這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大.但3′端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾,因?yàn)橐锏难由焓菑?′端開(kāi)始的.這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位,因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并,會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率.
綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計(jì)原則：
① 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性.
② 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu).
③ 引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間.
④ G+C含量在40%~60%之間.
⑤ 堿基要隨機(jī)分布.
⑥ 引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ).
⑦ 引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ).
⑧ 引物5′端可以修飾.
⑨ 引物3′端不可修飾.
⑩ 引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位.
PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段,使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列.如前述,引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否.對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功,但遵循某些原則,則有助于引物的設(shè)計(jì).
1.引物的特異性
引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源.
2.避開(kāi)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)
某些引物無(wú)效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域.用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu),有助于選擇模板.實(shí)驗(yàn)表明,待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時(shí),擴(kuò)增往往不能成功.若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí),用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的.
3.長(zhǎng)度
寡核苷酸引物長(zhǎng)度為15~30bp,一般為20~27mer.引物的有效長(zhǎng)度：Ln=2（G+C）+（A+T+,Ln值不能大于38,因?yàn)?38時(shí),最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性.
4.G+C含量
G+C含量一般為40%~60%.其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度,有效啟動(dòng)溫度,一般高于Tm值5~10℃.若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值,則有效引物的Tm為55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳.
5.堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布
引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā).
6.引物自身
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性.這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合.若用人工判斷,引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp.
7.引物之間
兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性,尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成.一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性.
8.引物的3′端
引物的延伸是從3′端開(kāi)始的,不能進(jìn)行任何修飾.3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能,除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中,引物3′端不能發(fā)生錯(cuò)配.
在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中,用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板,按95℃,25s；55℃,25s；72℃,1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下,引物3′端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的.A∶A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20,A∶G和C∶C錯(cuò)七下降至1/100.引物A：模板G與引物G：模板A錯(cuò)配對(duì)PCR影響是等同的.
9.引物的5′端
引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度,它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大.因此,可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性.引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等.
10.密碼子的簡(jiǎn)并
如擴(kuò)增編碼區(qū)域,引物3′端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并,會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率.
特殊目的的引物設(shè)計(jì)將在有關(guān)章節(jié)討論.隨著人們對(duì)引物的認(rèn)識(shí),一些引物的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)程序也應(yīng)運(yùn)而生,下面將討論有關(guān)引物計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)方法.
現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件有primer5.0比較好.