2.在框中粘貼入你的原始序列(要比你要擴(kuò)的目的片段兩端延伸一點(diǎn))
3.在框的下方有許多可以設(shè)定的限制條件,如片段長度,一定包含的片段位置,引物長度,引物退火溫度等,你可以進(jìn)行設(shè)定
4.點(diǎn)擊"pickup primers"就會出現(xiàn)下一頁,上面會列出多種設(shè)計(jì),一般來說,第一對引物是最適合的.
同時(shí)引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：
(1) 引物長度約為16-30bp,太短會降低退火溫度影響引物與模板配對,從而使非特異性增高.太長則比較浪費(fèi),且難以合成.
(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).
(3) 四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布,在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā).
(4) 引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng),以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對.
(5) 在引物內(nèi),尤其在3'端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu).
兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ),以防出現(xiàn)引物二聚體,減少產(chǎn)量.兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性.
(7) 引物5'端對擴(kuò)增特異性影響不大,可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等.通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基.
引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ).所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu),以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,影響產(chǎn)量.
(9) 簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子,例如選用只有一種密碼子的Met,3'端應(yīng)不存在簡并性.否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物.