這屬于專業(yè)問題啦 下面的簡單方案是Clhen等(1972)所用方法的變通方案,常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌,這些細(xì)菌可使每微克螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5x106-2x107 個(gè)轉(zhuǎn)化菌落,這樣的轉(zhuǎn)化效率足以滿足所有在質(zhì)粒中進(jìn)行的常規(guī)克隆的需要.該方法完全適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株,并且比方案I快速,重復(fù)性更好.該法制備的感受態(tài)細(xì)胞可貯存于-70℃,但保存時(shí)間過長會(huì)使轉(zhuǎn)化效率在一定程度上受到影響.1、從于37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(直徑2-3mm),轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中.于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約3小時(shí)(旋轉(zhuǎn)搖床,300轉(zhuǎn)/分).為得到有效轉(zhuǎn)化,活細(xì)胞數(shù)不應(yīng)超過108細(xì)胞/ml,可每隔 20-30分種測量OD600值來監(jiān)測培養(yǎng)物的生長情況.在菌株與菌株之間,OD600值和每毫升中活細(xì)胞數(shù)間的關(guān)系變化很大,因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長增減物在生長周期的不同時(shí)相的OD600值,并將各濃度的增減物鋪于無抗生素的LB瓊脂平皿以計(jì)算每一時(shí)相的活細(xì)胞數(shù),從而使分光光度讀數(shù)得到標(biāo)化.2、在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管(Falcon 2070)中,在冰上放置10分鐘,使培養(yǎng)物冷卻至0℃.切記：下述所有步驟均需無菌操作.3、于4℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭(或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭)以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,以回收細(xì)胞.4、倒出培養(yǎng)液,將管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡.5、以10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份沉淀,放置于冰浴上.我們發(fā)現(xiàn)將1mol/L CaCl2貯存液用純水(Mille-Q級(jí)或與其相當(dāng)?shù)募?jí)別)配制以10ml小份貯存于-20℃煞是方便.制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí),取一小份融化,用純水稀釋至100ml,用Nalgene濾器(0.45μm孔徑)過濾除菌,然后驟冷到0℃即可.對(duì)于大多數(shù)大腸肝菌菌株(除MC1061外),在這一步采用TFB代替氯化鈣可得到相同的或更好的結(jié)果.6、于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,以回收細(xì)胞.7、倒出培養(yǎng)液,將管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡.8、每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2[或TFB,見步驟5,注]重懸每份細(xì)胞沉淀.此時(shí),可將細(xì)胞分成小份,放于-70℃凍存.在這些條件下,盡管長期保存后轉(zhuǎn)化效率會(huì)稍有下降,但細(xì)胞仍可保持處于感受態(tài).Dagert和Ehrlich(1979)曾表明細(xì)胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48小時(shí),在貯存的最初12-24小時(shí)內(nèi),轉(zhuǎn)化效率增加3-5倍,然后降低到初始水平.9、用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中,每管加DNA(體積∞10μl,DNA∞50ng),輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物,在冰中放置30分鐘.10、將管放到預(yù)加溫到42℃的循環(huán)水浴中放好的試管回上,恰恰放置90秒,不要搖動(dòng)試管.11、快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻1-2分鐘.12、每管加800μl SOC培養(yǎng)基.用水溶將培養(yǎng)基加溫至37℃,然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上,溫育45分鐘細(xì)菌復(fù)蘇,并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因.如果要求更高的轉(zhuǎn)化效率,在復(fù)蘇期中,應(yīng)溫和地?fù)u動(dòng)細(xì)胞(轉(zhuǎn)速不超過225轉(zhuǎn)/分).13、將適當(dāng)體積(每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB瓊脂培養(yǎng)基上.如培養(yǎng)物體積太小(〈10μl).可再加肉湯培養(yǎng)基,用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂到瓊脂平板表面.如在一個(gè)90mm平板上鋪200μl以上的感受態(tài)細(xì)胞,應(yīng)離心濃縮細(xì)胞,然后用適量SOC輕輕重懸細(xì)胞.如用四環(huán)素抗性作為選擇標(biāo)記,全部的轉(zhuǎn)化混合物可以鋪在一個(gè)單獨(dú)的平皿上(或鋪在軟瓊脂中).然而如選用氨芐青霉素抗性,則只能將一部分培養(yǎng)物(根據(jù)實(shí)驗(yàn)決定)鋪在單獨(dú)的平皿上.氨芐青霉素抗性功的增加與平皿上所加細(xì)菌數(shù)的增加并無線性比例關(guān)系,這可能是因?yàn)楸豢股貧⑺赖募?xì)胞可釋放生長掏物質(zhì)的緣故.14、將平板置于室溫直至液體被吸收.15、倒置平皿,于37℃培養(yǎng),12-16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落.如檢查氨芐青霉素抗性,用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪增板時(shí)密度較低(每個(gè)90mm平板不超過104菌落),于37℃培養(yǎng)平板時(shí)不應(yīng)超過20小時(shí).氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化可將β-內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中,迅速滅活菌落周圍區(qū)域中的抗生素.這樣,鋪平板時(shí)密度太高或培養(yǎng)時(shí)間太長都會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)對(duì)氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落.在選擇培養(yǎng)基中不用氨芐青霉素而改用羧芐青霉素,以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml,可使情況有所改善,但不能徹底根除之.