大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
準(zhǔn)備：
　　一.材料
　　E.coli DH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS質(zhì)粒DNA:購(gòu)買(mǎi)或?qū)嶒?yàn)室自制,eppendorf管.
　　二.設(shè)備
　　恒溫?fù)u床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺(tái)式高速離心機(jī),無(wú)菌工作臺(tái),低溫冰箱,恒溫水浴鍋,制冰機(jī),分光光度計(jì),微量移液槍.
　　三.試劑
　　1.LB固體和液體培養(yǎng)基
　　2.Amp母液
　　3.含Amp的LB固體培養(yǎng)基:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲(chǔ)存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板.
　　4.麥康凱培養(yǎng)基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌,待冷至60℃左右加入Amp儲(chǔ)存液使終濃度為50ug/ml,然后搖勻后涂板.
　　5.0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無(wú)水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌.
　　6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:稱取0.28g CaCl2(無(wú)水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌.
操作步驟：
　　一、 受體菌的培養(yǎng)
　　從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期.將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600 ＝0.5左右.
　　二、 感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法)
　　1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘.
　　2、 棄去上清,用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘.
　　3、棄去上清,加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液.
　　4、 感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年.
　　三、 轉(zhuǎn)化
　　1、從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上.
　　2、 加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過(guò)50ng,體積不超過(guò)10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后.
　　3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘.
　　4、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr ).
　　5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時(shí),待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時(shí).
　　同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照:
　　對(duì)照組1:以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同.此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒(méi)有菌落出現(xiàn).
　　對(duì)照組2:以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時(shí)只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落.
　　四、 計(jì)算轉(zhuǎn)化率
　　統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù).
　　轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子,根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率,公式如下：
　　轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積
　　轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg)
　　感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對(duì)照組2菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積
　　感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)
　　[注意] 本實(shí)驗(yàn)方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化.但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣.有的轉(zhuǎn)化效率高,需將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉(zhuǎn)化效率低,涂板時(shí)必須將菌液濃縮(如離心),才能較準(zhǔn)確的計(jì)算轉(zhuǎn)化率.