首先,要確定引物設(shè)計(jì)成功了啊.
其次,確定試劑都是好的.
再次,確定模板DNA是沒有降解太厲害.
還有就是PCR房間溫度要控制在室溫狀態(tài).
像這種夏天要要保持在25--30度室溫.
以上都確定了之后,我建議你設(shè)計(jì)一下touchdown程序（每個(gè)循環(huán)降0.5度,這個(gè)具體程序你去查查,既可以減少非特異擴(kuò)增,而且不用摸退火溫度條件）.
你還可以摸摸溫度梯度咯.這個(gè)程序就是那個(gè)Gradient選項(xiàng)（前提你的PCR儀是可以做溫度梯度的PCR）.
如果所有的溫度梯度都擴(kuò)增不出來(lái),我就傾向于是你的引物設(shè)計(jì)不好了.
一般退火溫度越高,越不容易出現(xiàn)非特異,它對(duì)引物和模板的匹配要求很高.如果擴(kuò)增不出來(lái),可以考慮降低退火溫度,這樣雖然容易出現(xiàn)非特異片段,但是目的片段也相應(yīng)容易擴(kuò)增出來(lái).