[原理]
植物組織中的丙二醛(MDA) 在酸性條件下加熱可與硫代巴比妥酸(TBA) 產(chǎn)生顯色反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物為粉紅色的3,5,5一三甲基惡唑2,4一二酮(Trimet—nine).該物質(zhì)在539nm波長下有吸收峰.由于硫代巴比妥酸也可與其它物質(zhì)反應(yīng),并在該波長處有吸收,為消除硫代巴比妥酸與其它物質(zhì)反應(yīng)的影響,在丙二醛含量測定時(shí),同時(shí)測定600nm下的吸光度,利用539nm與600nm下的吸光度的差值計(jì)算丙二醛的含量.
植物組織丙二醛含量測定
植物葉片在衰老過程中發(fā)生一系列生理生化變化,如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等.這些指標(biāo)在一定程度上反映衰老過程的變化.近來大量研究表明,植物在逆境脅迫或衰老過程中,細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞而有利于活性氧的積累.活性氧積累的危害之一是引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用,造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡.活性氧包括含氧自由基.自由基是具有未配對(duì)價(jià)電子的原子或原子團(tuán).生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧主要有超氧自由基(O-2)、羥自由基(OH·)、過氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（O21）等.植物對(duì)活性氧產(chǎn)生有酶促和非酶促兩類防御系統(tǒng),超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶POD和抗壞血酸過氧化物酶(ASA—POD)等是酶促防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶,抗壞血酸(ASA)和還原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑.
丙二醛(MDA)是細(xì)胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一,它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷.因此,丙二醛產(chǎn)生數(shù)量的多少能夠代表膜脂過氧化的程度,也可間接反映植物組織的抗氧化能力的強(qiáng)弱.所以在植物衰老生理和抗性生理研究中,丙二醛含量是一個(gè)常用指標(biāo).
[材料、儀器、藥品]
1．材料：植物抗逆性鑒定實(shí)驗(yàn)中的四種菠菜樣品,即綠色和黃色葉片的高溫處理和室溫對(duì)照.
2．儀器：(1) 分光光度計(jì)；(2) 離心機(jī)；（3）水浴鍋：(4) 天平；(5) 研缽；(6) 剪刀；(7) 5ml刻度離心管；(9) 刻度試管(10ml)；(10) 鑷子；(11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱.
3．藥品：(1) 0.05mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液；(2) 石英砂；(3) 5％三氯乙酸溶液：稱取5g三氯乙酸,先用少量蒸餾水溶解,然后定容到100ml；(4) 0.5％硫代巴比妥酸溶液：稱取0.5g硫代巴比妥酸,用5％三氯乙酸溶解,定容至100ml,即為0.5％硫代巴比妥酸的5％三氯乙酸溶液.
[方法]
1．丙二醛的提?。喝?.5g樣品,加入2ml預(yù)冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸緩沖液,加入少量石英砂,在經(jīng)過冰浴的研缽內(nèi)研磨成勻漿,轉(zhuǎn)移到5ml刻度離心試管,將研缽用緩沖液洗凈,清洗也移入離心管中,最后用緩沖液定容至5ml.在4500轉(zhuǎn)/min離心10min.上清液即為丙二醛提取液.
2．丙二醛含量測定：吸取2 ml的提取液于刻度試管中,加入0.5％硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml,于沸水浴上加熱10min,迅速冷卻.于4500轉(zhuǎn)/min離心10min.取上清液于532、600nm波長下,以蒸餾水為空白調(diào)透光率100%,測定吸光度.
3．結(jié)果計(jì)算：
(A532—A600) ×V1×V
1.55×10-1×W×V2
丙二醛含量（nmol/g）=
式中：A為吸光度；V1為反應(yīng)液總量(5m1)；V為提取液總量(5ml)；V2為反應(yīng)液中的提取液數(shù)量(2ml)；W為植物樣品重量(0.5g)；1.55×10-1為丙二醛的微摩爾吸光系數(shù)（在1升溶液中含有1µmol丙二醛時(shí)的吸光度）.
4．注意事項(xiàng)：
(1) 0.0.5％的三氯乙酸對(duì)MDA—TBA反應(yīng)較合適,若高于此濃度,其反應(yīng)液的非專一性吸收偏高；
(2) MDA—TBA顯色反應(yīng)的加熱時(shí)間,最好控制沸水浴10~15min之間.時(shí)間太短或太長均會(huì)引起532nm下的光吸收值下降；
(3) 如用MDA作為植物衰老指標(biāo),首先應(yīng)檢驗(yàn)被測試材料提取液是否能與TBA反應(yīng)形成532nm處的吸收峰.否則只測定532、600nm兩處A值,計(jì)算結(jié)果與實(shí)際情況不符,測得的高A值是一個(gè)假象；
(4) 在有糖類物質(zhì)干擾條件下(如深度衰老時(shí)),吸光度的增大,不再是由于脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的升高,而是水溶性碳水化合物的增加,由此改變了提取液成分,不能再用532nm、600nm兩處A值計(jì)算MDA含量,可測定510、532、560nm處的A值,用A532一(A510—A560)/2的值來代表丙二醛與TBA反應(yīng)液的吸光值.