overlap
一、用這對引物
A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttg
A2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag
擴增出片段A,產物長2540bp左右[color=Red]
已割膠回收,即片段A
二、用這對引物
B1- F：tcttcccggcgccccaatgcgcgcaccatggtgagcaagggcgaggaggtcatc
B2- R：cggatatccgatacattgatgagtttggacaaaccac
擴增出B片段,產物長1680bp
已割膠回收,即片段B
三、把一、二步中得到的PCR產物A、B通過overlap PCR連接起來,產物長4200bp左右
使用引物：
A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttg
B2- R：cggatatccgatacattgatgagtttggacaaaccac
就在這一步問題出現(xiàn)了,就是這步做了N多次,就是PCR不出目標條帶,（每一次pcr產物都會出兩個雜帶很亮大約一個1100bp,一個1800bp,始終無目標帶）
本人使用primestar酶 采用溫度梯度(50度至65度)、模板1:1濃度梯度（20ng至200ng）、同時也采用了兩步法（68度5分鐘或者72度5分鐘退火延伸）.也使用過LATAQ酶 PfuUltra IIFusion HS DNA Polymerase 酶.都沒擴增出目標條帶.
也采用過體系中僅僅不加引物直接跑PCR20個循環(huán),在加入引物在跑30個循環(huán)（也這樣做過,取該體系中混合液2微升做模板,在重新做一次該PCR）結果還是沒有目標條帶.
以上PCR全是延伸5分鐘,終延伸10分鐘.具體的PCR都是按照酶的說明書操作.
本人可以說在實驗過程中可以完全不用考慮因實驗操作導致失敗---這點可以肯定無誤!