[原理]
血清中蛋白質(zhì)按電泳法一般可分為五類：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白,其中γ-球蛋白含量約占16％,100ml血清中約含1.2g左右.
首先利用清蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中(常用硫酸銨)溶解度的差異而進行沉淀分離,此為鹽析法.半飽和硫酸銨溶液可使球蛋白沉淀析出,清蛋白則仍溶解在溶液中,經(jīng)離心分離,沉淀部分即為含有γ-球蛋白的粗制品.
用鹽析法分離而得的蛋白質(zhì)中含有大量的中性鹽,會妨礙蛋白質(zhì)進一步純化,因此首先必須去除.常用的方法有透析法、凝膠層析法等.本實驗采用凝膠層析法,其目的是利用蛋白質(zhì)與無機鹽類之間分子量的差異.當(dāng)溶液通過SephadexG--25凝膠柱時,溶液中分子直徑大的蛋白質(zhì)不能進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔,而分子直徑小的無機鹽能進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔之中．因此在洗脫過程中,小分子的鹽會被阻滯而后洗脫出來,從而可達到去鹽的目的.
脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液尚含有各種球蛋白,利用它們等電點的不同可進行分離.α－球蛋白、β-球蛋白的PI4為止.加等體積lmol/L氫氧化鈉溶液,使最終濃度約為0.5mol/L氫氧化鈉,攪拌后放置30min,以虹吸除去上層液體.同上用蒸餾水反復(fù)洗至pH