(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制,也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P0012A).該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方.(主要分為濃縮膠和分離膠,配方可自己上網(wǎng)查下)
(2) 樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮[V1] 的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液.例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液.使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品.5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻資料配制,也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(P0015).
100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白[V2] .
(3) 上樣與電泳
冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可.
為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P0066).
電泳時電泳液可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液(P0014A/P0014B).
電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳,而在溴酚藍(lán)進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳.對于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置,低電壓可以設(shè)置在80-100V,高電壓可以設(shè)置在120V左右.SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求,也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)(EEP102).為了電泳方便起見,也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式,通常把電壓設(shè)置在100V,然后設(shè)定定時時間為90－120分鐘.設(shè)置定時可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭.
通常電泳時溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況,預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳.
3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)[V3]
我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜(FFP30/FFP33).硝酸纖維素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用,但硝酸纖維素膜比較脆,在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開.膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟.
通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置,可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA,轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘.也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜.轉(zhuǎn)膜時也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)(EEP102).具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時間越長,目的蛋白的分子量越小,需要的轉(zhuǎn)膜時間越短.
在轉(zhuǎn)膜過程中,特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時,通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象,最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進行轉(zhuǎn)膜.
轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上.轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進行染色,以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果.也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液(P0017)對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進行染色,以觀察蛋白的殘留情況.
4. 封閉(Blocking)
轉(zhuǎn)膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液(P0023C)中,漂洗1-2分鐘,以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液.從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景[V4] .
用微型臺式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸盡洗滌液,加入Western封閉液(P0023B),在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘.對于一些背景較高的抗體[V5] ,可以4℃封閉過夜.在整個Western過程中我們推薦使用碧云天的側(cè)擺搖床(ESHK02)或類似儀器,側(cè)向擺動速度比較緩慢,而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜.
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
參考一抗的說明書,按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液(P0023A)稀釋一抗.
用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時.如果一抗孵育一小時效果不佳,可以4℃緩慢搖動孵育過夜.或根據(jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r間.
回收一抗[V6] .加入Western洗滌液(P0023C),在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘.吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5-10分鐘.共洗滌3次.如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù).
注：Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對照,通?？梢赃x用Tubulin抗體(AT819)或Actin抗體(AA128),進行內(nèi)參檢測.
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
參考二抗的說明書,按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液(P0023D)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗. 二抗需根據(jù)一抗進行選擇,例如,一抗是小鼠來源的IgG,則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗,如辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216).碧云天有多種二抗提供.
用微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時.
回收二抗.[V7] 加入Western洗滌液(P0023C),在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘.吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5-10分鐘.共洗滌3次.如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù).
7. 蛋白檢測(Detection of proteins)
參考相關(guān)說明書,使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL類試劑來檢測蛋白.壓片可以采用專用的壓片暗盒(FFC58/FFC83)進行.
洗片時可以使用X光片自動洗片機.如果沒有自動洗片機,可以用顯影定影試劑盒(P0019/P0020)自行配制顯影液和定影液進行手工洗片.X光片推薦選用柯達(dá)原裝的生物實驗專用柯達(dá)X-OMAT BT膠片(FF057/FF081).
8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)
如果蛋白樣品非常寶貴,可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)處理蛋白膜,以重復(fù)利用蛋白膜.
[V1]為什么要加緩沖液?提取的樣品是等體積的么? [V2]? [V3]過程?傳膜之后怎么沒色? [V4]? [V5]蛋白? [V6]還能反復(fù)利用? [V7]還能反復(fù)利用?