反膠束萃取制備胰蛋白酶
　　胰蛋白酶（EC 3 . 4 . 4 . 4 ）是從豬、牛等哺乳動物胰臟提取的一種以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶,可提高組織、血管的通透性、液化血塊、血膿纖維及壞死組織等,用于治療炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷等引起的膿腫及支氣管炎、肺氣腫等.
　　( 1 ）工藝流程
　　( 2 ）主要步驟
　?、?制備粗酶液 稱取定量粗胰酶,其胰蛋白酶活性為25 . 7U /mg,胰淀粉酶活性為18.4U/mg,胰脂肪酶活性為63.7U/mg.將其用pH 值為5 . 25 、濃度為0．2mol / L 的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解,然后進行真空過濾,收集濾液并用磷酸緩沖液進行稀釋,使胰蛋白酶活性為3-10U / mg ,備用.
　?、?制備反膠束 將AOT置于100 ℃ 烘箱中干燥至恒重,放入干燥器中冷卻至室溫.然后稱取44.4369 置于配制罐中,加入10L異辛烷,在攪拌下使其形成均勻的分散液,再加入定量蒸餾水,在200r/min的轉(zhuǎn)速下處理2h ,獲得濃度為0 .lmol / L 的透明AOT-異辛烷反膠束溶液.使用時用異辛烷稀釋10 倍.
　　③ 萃取 將稀釋10 倍的AOT-異辛烷反膠束置于萃取器中,按照AOT 異辛烷反膠束：粗酶溶液體積比為（2 -3 ) : 1 的比例加入粗酶溶液萃取3 - 4 次,在300 - 400r / min 的轉(zhuǎn)速下萃取5 -10min .如此每次萃取完成后,均進行離心分離,離心機轉(zhuǎn)速為4000 - 6000r / min ,時間10 -15min 收集、合并離心上層清液,進行反萃取,下層萃余液用于制備胰脂肪酶.
　　④ 反萃取 將荷載胰蛋白酶的AOT -異辛烷反膠束置于萃取器中,在攪拌下加入等體積的反萃取液進行反萃取15 -20min 萃取液為0．02 -0.05mol / L 的NaCI 溶液.如此反萃取3 次,每次萃取完成后,均進行離心分離,離心機轉(zhuǎn)速為4000 -6000r / min,時間為15 -20min .分別收集、合并離心上層清液和下層反萃取液,前者再生后可再次萃取胰蛋白酶,后者進行超濾濃縮.
　　⑤ 脫鹽、濃縮 將反萃取液置于截留分子量2 萬的超濾膜中,在0 . 1 ～0.2MPa 的壓力下進行脫鹽及濃縮處理,直至處理液體積降低至原液體積的1 / 5 左右時停止,獲得脫鹽濃縮液.
　?、?干燥 將濃縮液置于凍干瓶中,在-60～-50 ℃ 、真空度為25～5OMPa 的條件下干燥24h ,獲得純化胰蛋白酶凍干粉.
　　( 3 ）主要指標
　　淺黃色粉末,胰蛋白酶的總萃取率為74 . 2 % ,胰蛋白酶活性為3145 . 3U/ mg ,純化45 . 16 倍；胰淀粉酶活性為0 . 58U / mg ,降低4 . 66 倍；無脂肪酶活性.
　　實例234 豬胰中分離核糖核酸酶A、胰蛋白酶、凝乳蛋白酶和激肚釋放酶
　　采用提取、鹽析、反膠束、離子交換、凝膠分子篩層析等技術(shù),可從豬胰臟中同時獲得核糖核酸酶A 、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和激膚釋放酶,有顯著的經(jīng)濟效益.
　　( 1 ）用該方法同時制備上述四種酶的工藝流程
　　( 2 ）主要步驟
　　① 提取、鹽析 取0.5kg 豬胰,除脂肪及結(jié)締組織后絞碎,加入其3 倍質(zhì)量的乙酸提取液攪拌提取24h .提取液溫度為4 ℃ ,pH 值為4 . 0 ,硫酸濃度為0．125mol / L .提取完成后用4 層紗布過濾,收集濾過液約1250-1300mL ,在攪拌下加入約750g 固體硫酸錢溶解,使溶液達到75 ％飽和度.4000r / min 轉(zhuǎn)速離心15min , 分別收集上層清液（約1500mL ）和鹽析沉淀物（約40 -45g ）.
　?、?制備核糖核酸酶A 取收集的上層清液,在攪拌下加入固體硫酸銨溶解,使溶液達到85 ％飽和度.4 000r / min 轉(zhuǎn)速離心15min ,棄清液.將沉淀溶于等體積蒸餾水,用10 ％乙酸鈉調(diào)節(jié)pH 值為6 . 0 ,上用濃度為0 .0lmol / L 、pH6 .0磷酸緩沖液（PBS ) 平衡過的CM - SepharoseFF 柱,CM - SepharoseFF 用量與上柱液體積之比為1 : 5 ( g / mL ）.接著用2 倍樹脂床體積的上述平衡緩沖液洗滌荷載核糖核酸酶A 的CM -SepharoseFF 色譜柱后,分別用0．01mol / L 、pH6 ．0和0．lmol / L 、pH7 . 5 磷酸緩沖液進行梯度洗脫,收集活性峰液,調(diào)節(jié)其pH 值為8 . 0 ,上用0．05mol / L 、pH 8 . 0 磷酸緩沖液平衡的Sephacryls -200 柱,Sephacryls -200 用量與上柱液體積之比為1 : 5 （g/mL ）.然后用同樣的緩沖液梯度洗脫,收集活性峰液,進行透析、脫鹽、凍干,獲得核糖核酸酶A 凍干粉.
　?、?制備胰蛋白酶取75 ％飽和度的硫酸錢鹽析沉淀,用10 倍蒸餾水溶解,加入鹽析沉淀質(zhì)量30 ％的CaCI ：粉末,調(diào)節(jié)pH 值為8 . 0 ,再加入5 ～ 10mg 粗胰蛋白酶,于4 ℃ 下激活24h .過濾除去硫酸鈣沉淀,調(diào)節(jié)濾液pH 值為7 . 8 ,加入定量對氨基苯甲脒－sepharose6B ,攪拌下吸附lh ,紗布過濾,收集濾液用于分離其他酶.將吸附胰蛋白酶的對氨基苯甲瞇一S 叩harose6B 樹脂用pH 值為7 . 8 、濃度為0 . lmol / L Tris 一0 .05mol / L HCI 的緩沖液（含0 . lmol / L CaC12 ）抽濾洗滌,緩沖液用量為樹脂體積的2 倍.洗滌完成后將樹脂裝柱,用其1 倍體積的相同緩沖液平衡.再用20 倍樹脂體積的0 . lmol / L 甲酸-0 . 05mol / L KCI 緩沖液洗脫,洗脫液pH 值為2 . 2 ,洗脫流速為2 ～3 倍樹脂體積／h .收集洗脫活性峰進行透析,凍干,獲得胰蛋白酶.
　?、?彈性蛋白酶制備取未被對氨基苯甲脒-Sepharose6B 吸附的濾液,對水透析至透析管內(nèi)產(chǎn)生沉淀時止.用400Or / min 的轉(zhuǎn)速離心15min ,收集上層清液用于制備彈性蛋白酶.沉淀用5 ～ 6 倍體積的Tris-HCI 緩沖液溶解,該緩沖液濃度為0．02mol / L 、pH 值為8 . 8 .將溶解液用稀NaOH 調(diào)節(jié)pH 值為10 . 4 ,上用上述緩沖液平衡好的DEAE －纖維素柱,溶解液與DEAE -纖維素的比為（5 ～6 ) ： 1 ( mL / g ）.上柱完成后再用同樣的緩沖液以2 ～3 倍樹脂體積／h 的流速洗滌,緩沖液用量為1 倍樹脂體積.彈性蛋白酶在此條件下不被交換,收集洗滌活性峰,對水透析,凍干,即得彈性蛋白酶.比活力2010U / mg ,活力回收10 ％.
　　⑤ α-糜蛋白酶制備 將制備彈性蛋白酶時的離心清液用乙酸鈉調(diào)節(jié)pH 值為5 ．0,上用0 . lmol / L 、pH 5 . 0 檸檬酸緩沖液平衡的S- SepharoseFF 柱.用2 倍柱體積的、同樣緩沖液以3mL / min 洗滌樹脂,收集洗滌液待制備激膚釋放酶.用300mL 0 . 01～0.05mol / L 、pH5.0檸檬酸緩沖液梯度洗脫,收集活性峰組分( 160 ～200mL ) ,透析,凍干,即得α-糜蛋白酶.
　?、?胰糜蛋白酶制備 取制備彈性蛋白酶時的離心上層清液,用乙酸鈉調(diào)節(jié)pH 值為3 . 5～ 4 . 0 ,加入等體積0.lmol / L AOT 反膠束,在200r /min 攪拌下萃取5min , 4000r / min 離心5min .收集上層有機相,萃余液再用等體積0.lmol / L AOT 反膠束重復(fù)萃取2 次.合并有機相,加入等體積、含lmol / L KCI 、pH8.0的0.02mol / L 碳酸鹽緩沖液,在200r /min 攪拌下反萃取5min , 60 00r/min 離心5min ,收集下層水相,萃余液同法反萃取2 次.合并反萃取液,對水透析脫鹽,凍干,得胰糜蛋白酶.
　?、?激肽釋放酶制備 取用0.01mol/ L 、pH 5.0檸檬酸緩沖液洗滌S-SepharoseFF 柱的洗滌液,用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值為4 . 5 ,按洗滌液：丙酮=1：0.35 的比例加入丙酮,于-4 ℃ 冰箱中放置2h , 過濾.濾液中加入乙酸鈉和NaCI ,使其濃度分別達到0.O65mol / L 和0.035mol / L .繼續(xù)加入丙酮,使體積比達到65 ％.抽濾,濾餅用少量蒸餾水溶解,用稀乙酸調(diào)節(jié)pH 值為4 . 2 ,再次產(chǎn)生沉淀.抽濾,濾餅用少量蒸餾水溶解后用稀乙酸鈉調(diào)節(jié)pH 值為6 . 8 ,對水透析脫鹽后上用濃度為0.1mol / L 、pH6 . 8 磷酸緩沖液平衡的輕基磷灰石柱,上柱液與經(jīng)基磷灰石的比為（5 ～ 6 )：l ( mL / g ）.用0 . 01 ～0.2mol/L 、pH6 . 8 磷酸緩沖液以1～ 1 . 5 倍樹脂柱體積／h 進行梯度洗脫,洗脫液用量約為上柱液體積的1～1 . 5 倍.收集活性峰組分,對水透析脫鹽后加到經(jīng)過重新平衡的另一羥基磷灰石柱上,改用0.05 ～0.2mol / L 、pH6 . 8 磷酸緩沖液進行梯度洗脫.收集活性峰組分,再次對水透析脫鹽后,凍干,獲得激肽釋放酶.
　　( 3 ）主要指標
　　核糖核酸酶A 的活力回收≥75 .％,比活力為71000U/mg；胰蛋白酶的活力回收≥60 % ,比活力為23750U / mg ；彈性蛋白酶的活力回收≥10 % ,比活力為2010 U / mg ；胰糜蛋白酶活力回收≥70 % ,比活力為150U / mg ；胰激膚釋放酶活力回收≥6 % ,比活力為130U / mg .