1.首先這應(yīng)該是個(gè)融合表達(dá)載體.應(yīng)該考慮后面的讀碼框問(wèn)題.就是應(yīng)該適當(dāng)在后面的酶切位點(diǎn)前加入0-2個(gè)堿基.使得你的目的基因和egfp在同一讀碼框內(nèi).
2.KOZAK序列在真核細(xì)胞中表達(dá)有作用,這就看你后期的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧?不過(guò)不加的話應(yīng)該只是效果沒(méi)有加了好,而不是沒(méi)有效果.下游當(dāng)然不用加.
3.NEB公司的網(wǎng)站上有特定酶的保護(hù)堿基圖表.他們應(yīng)該都是進(jìn)行過(guò)研討的,所以建議您參考這個(gè).
4.克隆目的基因當(dāng)然要保證從ATG開(kāi)始.到終止碼結(jié)束.這樣叫一個(gè)完整的CDS區(qū),表達(dá)一個(gè)完整的功能蛋白.不可以小于這個(gè)范圍,但是多出來(lái)也許可以吧.就是從兩側(cè)的UTR區(qū)開(kāi)始設(shè)計(jì).但是我不敢保證啊.所以我建議您先在UTR區(qū)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)出來(lái)長(zhǎng)片段后再擴(kuò)增您的目的片段.這樣會(huì)容易點(diǎn).
P.S.保護(hù)堿基的作用是可以使PCR產(chǎn)物兩端的酶切位點(diǎn)被識(shí)別,從而可以直接酶切PCR產(chǎn)物使其產(chǎn)生粘性末端,以便進(jìn)行后續(xù)的克隆.這和PCR能否擴(kuò)增出來(lái)沒(méi)有任何關(guān)系.