脲酶urease（水解酶）：
脲酶試驗(yàn)原理：
存在于大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里.它是一種酰胺酶、能酶促有機(jī)物質(zhì)分子中酶鍵的水解.脲酶的作用是極為專(zhuān)性的,它僅能水解尿素,水解的最終產(chǎn)物是氨和碳酸.土壤脲酶活性,與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效磷含量呈正相關(guān).根際土壤脲酶活性較高,中性土壤脲酶活性大于堿性土壤.人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況.
土壤中脲酶活性的測(cè)定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測(cè)定生成的氨量,也可以通過(guò)測(cè)定未水解的尿素量來(lái)求得.本方法是測(cè)定生成的氨量.
試劑：1）甲苯
2）10%尿素：稱(chēng)取10g尿素,用水溶至100ml.
3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：184克檸檬酸和147.5克氫氧化鉀溶于蒸餾水.將兩溶液合并,用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7,用水稀釋至1000毫升.
4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇,加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮,用乙醇稀釋至100毫升（A）,存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）.將AB溶液保存在冰箱中.使用前將2溶液各20毫升混合,用蒸餾水稀釋至100毫升.
5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑,至活性氯的濃度為0.9%,溶液穩(wěn)定.
6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：a 精確稱(chēng)取0.4717克硫酸銨溶于水并稀釋至1000ml,得到1ml含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：吸取配置好的氮溶液10ml,定容至100ml,即稀釋了10倍,吸取1,3,5,7,9,11,13ml移至50ml容量瓶,加水至20ml,再加入4ml苯酚鈉,仔細(xì)混合,加入3ml次氯酸鈉,充分搖蕩,放置20分鐘,用水稀釋至刻度.將著色液在紫外分光光度計(jì)上于578nm處進(jìn)行比色測(cè)定,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),以光密度值為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)圖.
取新鮮土壤7份,每份30g,裝于棕色廣口瓶中,先將1,3－二氯丙烯溶于丙酮（定量）,6份分別加入不同濃度均為1.5ml的1,3－二氯丙烯,使之在土壤中的濃度分別為1、10、50、100、200、500µg/g,另1份相應(yīng)加入1.5ml的丙酮作為對(duì)照,然后調(diào)節(jié)土壤的含水量至最大田間持水量的60%（記錄此時(shí)重量,以便補(bǔ)充水分）.放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)后第0d、1d,5d,10d（前10d密封,后來(lái)測(cè)定的敞口）、20d,30d,40d,50d分別取土樣檢測(cè)脲酶的活性.取樣前,反復(fù)旋轉(zhuǎn)廣口瓶,混勻土樣,一個(gè)處理隨機(jī)取3個(gè)重復(fù).
1) 稱(chēng)取5g過(guò)1mm篩的風(fēng)干土樣于100ml容量瓶中.
2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土樣濕潤(rùn)為度）并放置15分鐘
3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml檸檬酸緩沖液（PH6.7）,并 仔細(xì)混合
4) 將容量瓶放入37攝氏度恒溫箱中,培養(yǎng)24h
5) 培養(yǎng)結(jié)束后,用熱至38攝氏度水稀釋至刻度,仔細(xì)搖蕩,并將懸液用致密濾紙過(guò)濾于三角瓶中.
6) 顯色：吸取3ml濾液于50ml容量瓶中,加入10ml蒸餾水,充分震蕩,然后加入4ml苯酚鈉,仔細(xì)混合,再加入3ml次氯酸鈉,充分搖蕩,放置20分鐘,用水稀釋至刻度,溶液呈現(xiàn)（青定）酚的藍(lán)色.
7) 1h內(nèi)在（（青定）酚的藍(lán)色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）在分光光度計(jì)上用1cm液槽,于578nm處將顯色液進(jìn)行比色測(cè)定.
8) 無(wú)土對(duì)照：不加土樣,其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同.以檢驗(yàn)試劑純度,整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)對(duì)照
9)無(wú)基質(zhì)對(duì)照：以等體積的水代替基質(zhì),其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同.每個(gè)土樣都設(shè)此對(duì)照.
結(jié)果計(jì)算：土壤脲酶活性以24小時(shí)后100g土壤中NH3－N的毫克數(shù)表示.
M＝（X樣品－X無(wú)土－X無(wú)基質(zhì)）*100*10
式中：M－土壤脲酶活性值
X樣品――樣品實(shí)驗(yàn)的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上對(duì)應(yīng)的NH3－N毫克數(shù)
X無(wú)土――無(wú)土對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上對(duì)應(yīng)的NH3－N毫克數(shù)
X無(wú)基質(zhì)――無(wú)基質(zhì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上對(duì)應(yīng)的NH3－N毫克數(shù)
100 ――樣品定容的體積與測(cè)定時(shí)吸取量的比值
10 ――酶活性單位的土重與樣品土重之比值
注意事項(xiàng)：當(dāng)脲酶活性為3-80微克NH3-N時(shí),本法能獲得可靠結(jié)果.當(dāng)脲酶活性小于3微克NH3-N,培養(yǎng)時(shí)間需增至24小時(shí)（已經(jīng)24h了）（計(jì)算時(shí)應(yīng)考慮這一點(diǎn)）
計(jì)算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg數(shù)表示.
NH3-N（mg）＝a*2
A：從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得NH3-N毫克數(shù)
2 ：換算成1k土的系數(shù).