PCR反應(yīng)的五要素
1、引物
引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度.理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增.
設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
　　①引物長(zhǎng)度：15-30bp,常用為20bp左右.
　?、谝飻U(kuò)增跨度：以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段.
　　③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶.ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.
　?、鼙苊庖飪?nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3’端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶.
　?、菀?’端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗.
　?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點(diǎn),被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn),這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處.
　?、咭锏奶禺愋裕阂飸?yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性.引物量：每條引物的濃度0.1umol或10～100pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì).
2、酶
目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng),一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)),濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少.
3、dNTP
dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性.dNTP溶液呈酸性,使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris-HCl的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存.多次凍融會(huì)使dNTP降解.在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50～200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低),就會(huì)引起錯(cuò)配.濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量.dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低.
4、模板
模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本.SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸.提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng).一般臨床檢測(cè)標(biāo)本,可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴(kuò)增.RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
5、Mg2+濃度
Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),Mg2+濃度為1.2.0mmol/L為宜.Mg2+濃度過(guò)高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少.