在模板變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃(某個退火溫度)的時候,可使引物和模板發(fā)生結合.由于模板DNA 比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞,這就使PCR后期的過程成為可能.退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度.對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.
另一種說法：熔解溫度（Tm）是引物的一個重要參數(shù).這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的.在理想狀態(tài)下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結合.合理的退火溫度從55℃到70℃.退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃.
設定Tm有幾種公式.有的是來源于高鹽溶液中的雜交,適用于小于18堿基的引物.有的是根據(jù)GC含量估算Tm.確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法.這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩(wěn)定性.大部分計算機程序使用近鄰分析法.
Tm值除了用軟件之外,還可以這個公式：2（A+T）+4（C+G）,然后減5—10度
根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同,Tm會差異很大.因為大部分公式提供一個估算的Tm值,所有退火溫度只是一個起始點.可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性.開始低于估算的Tm5℃,以2℃為增量,逐步提高退火溫度.較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成.
為獲得最佳結果,兩個引物應具有近似的Tm值.引物對的Tm差異如果超過5℃,就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始.如果兩個引物Tm不同,將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃
或者為了提高特異性,可以在根據(jù)較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環(huán),然后在根據(jù)較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環(huán).這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝.
另外,由于PCR儀的不同,注意其退火溫度的設定：一般的PCR儀允許設置跨度12-15度的梯度范圍,所以你的梯度范圍盡可能設置寬一點,爭取一輪梯度就可以確定最佳可用退火溫度.
具體從多少度到多少度,要看你這對引物的Tm值,如果兩個引物Tm值不高,可以設置48-60的梯度；否則可以設置58-70度的梯度；如果兩個引物的Tm中等,則可以設置53-65的梯度范圍,具體情況靈活掌握.
傳統(tǒng)梯度PCR儀中是可以放置12個樣品進行梯度的,需要注意的是每個相鄰兩孔間的溫度差異是不等的,尤其是第2、3孔與第1孔接近,第10、11孔與第12孔接近.可以舍棄第2、2、10、11孔,只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8個樣品,孔間溫度變化幾乎呈真正的梯度狀.