凱氏定氮法、雙縮脲法(Biuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）
1.1 原理
凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定4 其原理是樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化,含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨,氨又與硫酸作用,變成硫酸銨.然后加堿蒸餾放出氨,氨用過量的硼酸溶液吸收,再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量.
2 雙縮脲法(Biuret )
2.1 原理
雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180 ℃左右加熱,放出1 個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物.在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4 形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng).凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵,或能夠以1 個(gè)中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應(yīng).紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測定蛋白質(zhì)含量.
3 紫外吸收法
3.1 原理
蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì),吸收峰在280 nm 處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比.此外,蛋白質(zhì)溶液在238 nm 的光吸收值與肽鍵含量成正比.利用一定波長下,蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定.
4 考馬斯亮藍(lán)法( Bradford)
4.1 原理
Bradford 法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的.考馬斯亮藍(lán)是一種有機(jī)染料,在游離狀態(tài)下呈紅色,在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸（ 特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色,其最大吸收波長從465 nm 變?yōu)?95 nm,蛋白質(zhì)在1～1 000 μg 范圍內(nèi),蛋白質(zhì)－色素結(jié)合物在595 nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比,故可用于蛋白質(zhì)的定量測定.
茚三酮反應(yīng)：所有氨基酸及具有游離α-氨基的肽與茚三酮反應(yīng)都產(chǎn)生藍(lán)紫色物質(zhì),只有脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生（亮）黃色物質(zhì).雖然蛋白質(zhì)和多肽具有茚三酮反應(yīng),但是肽鏈越大,靈敏度越差姑不適合作為定量測定.考馬斯亮藍(lán)法( Bradford　2．標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備：盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 　　3．將待測樣本溶于100~1緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。 　　4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過濾除去。 　　5．每個(gè)樣本加5ml稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應(yīng)不得超過30min． 　　6．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣本的濃度。 要是實(shí)驗(yàn)室有紫外分光光度計(jì)也行我也不知道你的實(shí)驗(yàn)步驟問題，不好意思要是你不能肯定是不是你實(shí)驗(yàn)的問題，你可以考慮一下，用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液做一下，要是這個(gè)也做不出來，可能你的實(shí)驗(yàn)存在問題，每一步要仔細(xì)一點(diǎn)，